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原生质体

制备与转化试剂盒

原生质体试验操作视频

1839年，捷克著名生理学家浦金野把填满细胞的胶状液体命名为原生质（生命的原始物质）。直到19世纪中叶以后，法国植物学家默尔用原生质（protoplasm）概括细胞中的所有内含物（包括细胞质和细胞核）。

原生质体 （protoplasast） 最早由Hanstein（1880）提出，是指“通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分物质” ^[1] 。通常认为原生质体是去掉细胞壁的植物细胞，是细胞内一团结构上具有复杂分化的原生质单位。植物原生质体虽然没有细胞壁，但仍然进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸合成、光合作用、呼吸作用、通过质膜的物质交换等，这样就非常有利于探讨许多细胞生理问题。更重要的是，植物原生质体在离体培养条件下能够再生细胞壁，继续生长和分裂，形成愈伤组织，经诱导分化再生成完整植株。即实现从原生质体到完整植株的克隆。原生质体培养的早期研究是采用机械法分离原生质体的，但由于这种分离方法操作烦琐、产量低，取材又局限于具有高度液泡化的细胞，从而使这一领域的研究进展缓慢。直到1960年，英国诺丁汉大学Edward首次从疣胞漆斑菌（Myrothecium verrcaria）分离得到纤维素酶，并用于分离出番茄幼根原生质体，才为植物原生质体培养打开了道路。此后，人们主要探索原生质体的分离和培养条件，为原生质体培养积累了丰富的基础资料。1970年日本的Takebe和Nagata首次对烟草叶片原生质体进行培养获再生植株，从此使该领域进人到迅速发展的阶段 ^[2, 3] 。

原生质体在植物生物学研究中发挥重要的作用 。由于植物细胞壁会阻止外源 DNA 进入细胞，植物原生质体被广泛用于 DNA 转化；也用于研究生物膜，包括纳米材料和病毒的摄取；用于体细胞的变异克隆；使用原生质体融合技术将原生质体用于植物育种等；在某些细胞中表达荧光蛋白的植物的原生质体可用于荧光活化细胞分选（FACS），方便保留特定波长发荧光的细胞。

原生质体也是一种非常好的瞬时表达系统 。原生质体瞬时表达技术被广泛应用于基因功能研究、植物生理生化过程研究和分子机制的研究（包括研究细胞信号转导过程、离子转运、细胞壁合成、蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程），以及生产有用的代谢产物、构建植物融合细胞、创制多倍体等。

基于原生质体的实验技术 包括蛋白亚细胞定位分析、基因瞬时表达分析、启动子活性分析、离子吸收实验、蛋白质互作验证（如 BiFC、FRET、荧光素酶互补和蛋白质免疫共沉淀）、染色质免疫共沉淀和单细胞测序等。

相对于动物细胞，植物细胞受到外层细胞壁的保护，为植物单细胞悬液的制备造成了更大的障碍。不同植物材料、不同类型细胞的细胞壁在组成成分上存在较大差异，导致没有通用的实验方法同时适用于不同植物、不同类型细胞的大规模、高质量原生质体的制备。除此之外，叶绿体含量太高，碎片杂质占比太高以及容易被染菌等，成为当下植物解离获取原生质体的主要阻碍，如何高效获取高质量原生质体成为当下亟需攻克的实验难题。

酶解法分离植物原生质体的核心就是酶分解细胞壁。细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。选择植物原生质体分离用酶主要有：纤维素酶 R-10、半纤维素酶 、果胶酶 Y-23、离析酶 R-10 及崩溃酶等，其中纤维素酶R-10、果胶酶 Y-23 最为常用于原生质体的分离。将降解纤维素的酶和降解果胶的酶混合使用，利用果胶酶分解果胶质的特性从组织中将细胞游离出来，再在纤维素酶的继续作用下把细胞壁分解而释放出原生质体。所以，酶液的种类、组合、浓度和酶解的时间对原生质体分离效果有很大影响。

外植体的选择对原生质体的分离十分重要，一般选择植物的幼嫩组织。普遍采用的外植体有根、下胚轴、幼叶、子叶等，生长在组培瓶中无菌幼苗最好，生长室的植株次之。不少人采用叶肉细胞分离原生质体，其优点是来源方便，供应及时，有明显的叶绿体，也方便进行亚细胞水平的定位。对于禾本科植物，常选择幼苗的叶鞘作为分离原生质体的材料。最适宜的细胞是处于分化早期的细胞，在分离后能够耐受一定的机械力和渗透压。

Coolaber经过多年反复试验，研发出了 水稻、玉米、小麦、拟南芥、烟草、大豆、番茄、柑橘、芸苔属 等植物原生质体分离试剂盒，能够实现高质量原生质体的快速分离、转化和培养，给广大植物科研工作者带来了福音。

试验 注意事项 ：

1) 酶解液应现用现配，配置后水浴加热。保证较高酶活性，可较完全的酶解出原生质体。

2) 植物材料尽量选择组培苗。材料的均一性与新鲜程度，决定了原生质体的得率与状态。

3) 请将植物材料切为0.5-1 mm的碎片。增加酶解液与其接触面积。

4) 整个实验流程应尽量避光操作。以免原生质体重新长出细胞壁，影响后续转化实验。

5) 过滤时，一定要将未酶解完全的材料挤压，使其有浓绿色液滴滴落。该步骤是原生质体的主要来源。

6) 在实验过程中，尽量缓慢温柔操作，以避免脆弱的原生质体物理破碎。包括较小的离心力、缓慢的升降速、温柔的吹打混匀等操作。

7) 在MMg重悬时，应调整原生质体浓度。确保后续的转化效率。

8) 使用去内毒素质粒进行转化。保证转化效率。

9) 在转化时，注意将原生质体与PEG温柔混匀，使其完全接触。保证转化效率。

10) 实验时应注意添加空载质粒做对照。确保实验操作无问题。

11) 建议添加预实验，并在每步操作后镜检，以检查实验员操作的规范性，在熟练掌握实验操作后，再进行正式实验。

1.  首次接触原生质体实验，有什么建议？

答：建议先进行预实验，待熟练掌握操作步骤后，再进行批量实验。建议在重要步骤后，取样镜检，观察原生质体状态，以排除自身操作失误。例如在酶解、重悬、转化等步骤后，进行镜检，判断实验方法是否正确。同时建议使用pBI221-EGFP（VT118）质粒进行转化，便于观察原生质体荧光。

2.  酶解时包裹锡纸的目的是什么？

答：其目的是保证酶解时的避光条件。光照会引起原生质体的光合作用和氧化反应，可能会影响原生质体膜活性，造成氧化损伤。因此避光可有效保护原生质体的活性与完整性，便于后续质粒的转入。例如在冰上孵育、转化、过夜孵育等步骤都需要保持避光条件。

3. 酶解出的原生质体数量少怎么办？

答：

1）选用新鲜组培苗，保证良好的植物状态。

2）用锋利刀片将材料切为0.5-1 mm的组织，增加与酶解液接触面积。

3）增加抽真空步骤，使酶解液完全浸入。

4）增加酶解时间，使其酶解充分。

5）在过滤时，用镊子挤压未被酶解组织。此步骤最为重要！

6）在重悬清洗弃上清时，避免损失沉淀。

4. 酶解出的原生质体破碎怎么办？

答：

1）原生质体十分脆弱，整个实验需尽量温柔操作。包括：用平滑的剪尖枪头吸打、用水平转子、缓慢的升降速离心、较低的离心力、圆底离心管进行离心等。

2）实验材料应选取新鲜健康的植株。

3） 挤压过滤时，应缓慢且用力的挤压，切忌快速捣戳植物组织。

5. 没有水平转子可以用角转子代替吗？

答：水平转子的效果会更好，但是角转子仍可正常进行实验。建议将离心力和升降速调低，增加离心时间，以使原生质体缓慢的离心至管底。

6. 在离心后，原生质体呈絮状沉淀，不易再次重悬，会有影响吗？

答：造成絮状沉淀的原因：①酶解后植物组织被过滤至离心管内；②原生质体因操作大量破碎；③原生质体量多大。解决方案：建议取样镜检，若原生质体质量较好，即可进行后续实验，不影响结果。

7. 已制备的原生质体需要立即进行转化吗？

答：需要。请计划实验时间，以便正常完成实验流程。制备后的原生质体请一次使用完毕，不能搁置第二天再次进行转化。同样，过夜孵育后的原生质体不能择日观察。

8. 原生质体转化效率低怎么办？

答：

1）原生质体浓度过高。在MMg重悬原生质体时，应调整其浓度，以免原生质体过多，导致超出体系转化限度。

2）应采用浓度＞1 μg/μL的去内毒素质粒。经验证，在植物原生质体转化实验中，去内毒素质粒较未去内毒素质粒的转化效率高1倍。

3）原生质体未与PEG混匀。必要时，可将离心管缓慢颠倒，并耐心的用枪头吸打，以保证在原生质体未破碎的情况下，使两者完全混匀。

9. 转化后原生质体大量破碎怎么办？

答：请将枪头贴于液面，加入PEG。以免高密度的PEG液滴砸向原生质体，导致物理破碎。

10. 共转时质粒的建议用量？

答：建议2种质粒的浓度为1000 ng/μL，各加入10 μL。

11. 怎么判断原生质体是否成功转化？

答：建议在实验过程中，增加荧光质粒（pBI221-EGFP）以做阳性对照。若过夜孵育后可观察到荧光，即默认实验组也可正常完成转化，可进行后续相关实验。

12. 孵育后原生质体的破碎是什么原因导致的？

答：若使用圆底离心管过夜孵育的方法会使原生质体破碎，建议使用下述更柔和的孵育方法进行实验。用1 mL 10%BSA润洗细胞培养板后，将1 mL培养液加入细胞培养板备用。将1 mL培养液重悬原生质体，将其加入上述细胞培养板中，室温过夜培养。

13. 购买Coolaber酷来搏原生质体试剂盒后，还需要额外购买其他产品完成实验吗？

答：本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，无需购买额外产品。但是仍建议购买“去内毒素质粒大提试剂盒（增强型）（PE036）”配合感受态和培养基进行质粒提取，经本公司实验证明，去内毒素后的质粒更适用于原生质体转化。

14. 原生质体试剂盒会参加优惠活动吗？

答：本试剂盒每次20 mL酶解液的使用量，可供5次原生质体制备以及120个转化反应，相对到每次转化反应的价格并不高。但是原生质体试剂盒仍会参加相关“买赠”活动，详见公众号或咨询客服。

15. 可以定制某种植物的原生质体试剂盒吗？

答：该问题烦请与本公司客服了解。对于特殊物种，本公司的售前服务会提供相关的酶解与转化建议，为客户提供实验思路与试剂定制服务。

1. 将10 μg去内毒素的pBI221-EGFP，转入拟南芥原生质体，转化效率高达57.38±13.1%，见图2。将10 μg去内毒素的pBI221-EGFP，转入玉米原生质体，转化效率高达48.32±6.28%，见图2。

图2 100倍镜检的拟南芥转化效率图（左明场，右荧光）

图3 100倍镜检的玉米转化效率图（左明场，右荧光）

2. 用不同量和不同质量的pBI221-EGFP，转入水稻原生质体，发现去内毒素且高浓度的质粒转化效率最高，为37.26±1.00%，见图4。

图4 水稻转化效率对比

3. 使用相关物种试剂盒的成果展示，见图5