缺氧诱导因子 2α (HIF-2α, hypoxia-inducible factor 2α) 是透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 的关键致癌驱动因素。 默沙东的第一代 HIF-2α 抑制剂 PT2385 在 ccRCC 患者中表现出良好的临床活性。然而，PT2385 受到可变且剂量有限的药代动力学的限制。本文描述了 第二代 HIF-2α 抑制剂 PT2977 的发现，该抑制剂通过氟取代实现了药效增强、及 减少 2 相代谢促进药代动力学特征的改善。对于小分子药物的PK优化具有显著参考意义，同样强调了临床候选分子多动物模型PK研究的重要性。 PT2977 （Belzutifan） 已于2021年获批 上市治疗透明细胞肾细胞癌，2025-02-18 批准上市用于治疗VHL综合征相关肿瘤。

肾癌是最常见的 10 种癌症之一。透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 是最常见的肾癌形式。尽管靶向疗法和免疫疗法已大大改善了 ccRCC 患者的预后，晚期或转移性疾病患者 5 年 存活率 只有 12%。对于患有转移性疾病的 ccRCC 患者，迫切需要更好的治疗方案。

在大多数患者中，ccRCC 的特征是由于遗传易感性、体细胞突变或甲基化导致肿瘤抑制因子 von Hippel–Lindau (VHL) 失活。VHL 蛋白 (pVHL) 是 E3 泛素连接酶复合物的组成部分，可介导蛋白酶体的蛋白质降解。pVHL 的主要作用是调节缺氧诱导因子 (HIF) 转录因子家族，包括 HIF-1α、HIF-2α 和较少表征的 HIF-3α。与 HIF-1α 不同，在成人中， HIF-2α 的表达仅限于内皮细胞、肾成纤维细胞、肝细胞、肠腔上皮细胞、胰腺间质细胞、心肌细胞、间质细胞和肺 II 型肺泡细胞。重要的是，HIF-2α 活性已被证实是 ccRCC 中的关键致癌驱动因素。在小鼠 ccRCC 肿瘤模型中，pVHL 缺陷细胞系中 HIF-2α 表达的抑制可抑制肿瘤生长，效果与重新引入 pVHL 相当。此外，稳定变体 HIF-2α 的表达能够克服 pVHL 的肿瘤抑制作用。HIF-2α 还被证实有助于其他恶性肿瘤（如多形性胶质母细胞瘤）的肿瘤形成，其中缺氧是肿瘤微环境的一个关键特征，并且已观察到 HIF-2α 活性与生存率之间的相关性。

HIF-2α 的活性受氧依赖性缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶 (PHD) 控制。 当氧气供应充足（常氧）时，这些酶会使 HIF-2α 氧依赖结构域上的特定脯氨酰残基羟基化，从而为 pVHL 产生底物识别位点。pVHL 识别修饰形式的 HIF-2α，与其结合，并将其作为靶标进行快速蛋白酶体降解。在缺氧条件下，PHD 没有足够的氧气来催化 HIF-2α 的羟基化，并且 pVHL 无法结合未修饰的 HIF-2α。因此，HIF-2α 会积聚并转移到细胞核中，在那里它与组成性表达的芳烃受体核转运蛋白 (ARNT，也称为 HIF-1β) 二聚化，形成活性转录因子复合物。该复合物可识别 DNA 上的缺氧反应元件 (HRE)，从而增加多种蛋白质的表达，其中许多蛋白质协同调节血管生成、增殖、迁移和免疫逃避。 在 ccRCC 中，绝大多数患者的 pVHL 存在缺陷或缺失，这导致 HIF-2α 即使在常氧条件下也会积累和转录激活。

尽管靶向 DNA 结合转录因子存在固有困难，但开创性的研究表明，与 HIF-2α 内袋结合的小分子可以变构抑制 HIF-2α 和 ARNT 之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用，从而抑制转录活性。在之前的报告中，我们披露了我们在迭代基于结构的药物设计和合理修改的指导下所做的努力，以确定一系列具有优异效力和物理和药理特性的新型 HIF-2α 抑制剂。这项工作导致了 第一代 HIF-2α抑制剂化合物 1 （PT2385） 的发现（ 图 1 ），这是第一个进入临床开发的 HIF-2α 抑制剂。虽然 PT2385 与高度可变的药物暴露相关，但在接受过大量治疗的晚期 ccRCC 患者中观察到抗肿瘤活性，提供了 HIF-2α 靶点验证。本文通过优化效力和 DMPK 特性导致了从 PT2385 到第二代临床候选 化合物 2 （PT2977） 的发现。

图 1.　化合物 1 和 2 的结构。

2. 第一代HIF-2α抑制剂PT2385：

人体临床暴露/药效不足

此前，评估 PT2385 安全性、药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 的首次人体研究在晚期 ccRCC 患者中完成。 PT2385 以 100-1800 毫克 的剂量口服(bid)，按照标准 3 + 3 剂量递增设计，随后以推荐的 2 期剂量 (RP2D， 800 mg bid ) 进行扩展阶段。 PT2385 耐受性良好，未观察到剂量限制性毒性。PT2385 治疗导致血浆促红细胞生成素 (EPO)（一种 HIF-2α 调节基因）在所有剂量下迅速下降，表明靶标参与的生物活性。PT2385 在这些接受过大量治疗的患者中表现出良好的抗肿瘤活性。与 PT2385 水平低于 500 ng/mL （ 1.4 个月 ）的患者相比，PT2385 谷浓度高于 500 ng/mL 的患者的 PFS（ 14.3 个月 ）有所改善（ 图 2 ）。PT2385 血浆浓度 500 ng/mL 相当于 786-O 细胞（VHL 突变 ccRCC 细胞）中VEGFA分泌试验中的 EC _{85 。} 在 786-O 小鼠异种移植模型中，PT2385 谷血浆浓度也需要达到 500 ng/mL 才能达到最大抗肿瘤活性。

图 2. 稳态暴露谷浓度为 <500 ng/mL（ 红线 ）的患者与谷浓度为 >500 ng/mL（ 黑线 ）的患者无进展生存期 (PFS) 曲线比较。

3. PT2385 的人体 PK 分析

对患者体内 PT2385 药代动力学曲线的评估表明，相当一部分患者暴露不足。所有 25 名接受单剂量 800 mg PT2385 (RP2D) 的患者的个体时间-血浆浓度曲线表明，患者可分为“正常暴露”组和“低暴露”组（ 图 3 ）。有 6 名患者属于“低暴露”组，他们从 PT2385 治疗中获得的临床益处很少。

预计 PT2385 在人体中的肝清除率将处于低到中等水平，在人肝微粒体 (HLM) 中的提取率 (ER 或观察到的清除率/肝血流量) 为 22% ，在人肝细胞中为 44% 。在人肝细胞孵育中，HPLC-UV 色谱图唯一可检测到的代谢物是 葡萄糖醛酸 PT2639 ( 图 4 A )，这表明 PT2385 在人体中的主要代谢途径可能是 葡萄糖醛酸化 。在临床前研究中，PT2639 不与 HIF-2α 结合，在闪烁近距离分析 (SPA) 中 IC ₅₀ 大于 100 μM。在 1 期临床试验中， 单次口服 800 mg PT2385 后 ，PT2639 的浓度明显高于 PT2385 （ 图 4B ）。平均 AUC 和 C _max 的代谢物/母体比分别为 6.9 和 9.7。根据临床前数据，患者体内 PT2639 的高浓度有些令人惊讶。虽然犬体内的 PT2639 循环水平很高（PT2639：PT2385 的 AUC 比 = 1.8），但小鼠体内并不存在，且大鼠体内的 PT2639 浓度明显低于 PT2385（PT2639：PT2385 的 AUC 比 = 0.24）。

在 I 期剂量递增研究中，PT2385 的 AUC 随着剂量从 100 mg 增加至 800 mg，通常与剂量成比例增加，而当剂量递增至 1800 mg 时并未进一步增加（ 图 5 A ）。 与母体药物不同，其代谢物 PT2639 在较高剂量下暴露量增加超过比例 （ 图 5 B ）。对于口服药物，水溶性是一个重要参数，可能导致生物利用度不足和变化。 PT2385 是 BCS 2 类 化合物，在 pH 7.4（15 μg/mL）时具有中等热力学水溶性，并且具有高渗透性。在临床前物种中，PT2385 在小鼠、大鼠和狗中表现出良好的口服生物利用度。 这表明PT2385 大量地代谢为 PT2639 可能是导致其药代动力学特征不佳的主要因素。

4. PT2385 临床中药代问题的机制？

为了确定哪种人类尿苷 5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 负责直接葡萄糖醛酸化 PT2385，将 11 种重组表达的 UGT 与 50 μM PT2385 一起孵育，并监测 PT2639 的形成 ( 图 6 )。结果表明 PT2385 是 UGT2B17 的底物 。UGT2B17 主要在人体肠道中表达，其在肠道中的含量远高于肝脏。UGT2B17 在肠道中的 mRNA 表达量比在肝脏中高出约 13 倍， 肠道中的蛋白质丰度比肝脏中高 4.4 倍。在所有 UGT 中，2B17 异构体在肠道中的表达最高。它占肠道中 UGT 异构体总量的 59%，但在肝脏中仅占 3%。基因多态性、肠道中高丰度都导致了口服 UGT2B17 代谢药物的暴露量不同，这可能是首过代谢的结果。

此外，评估了导致患者观察到的 PT2385 剂量限制性药物暴露的其他潜在机制。在小肠中，外排转运蛋白在葡萄糖醛酸代谢物的处置中起着重要作用。 P-gp、BCRP 和 MRP2 是小肠中表达的三种主要外排转运蛋白。 浓度高达 300 μM 时，PT2385 和 PT2639 在 MDCKII-MDR1 和 MDCKII-BCRP 细胞中的 外排比小于 2 ，这表明它们不是 P-gp 或 BCRP 的底物。在表达人类 MRP2 蛋白的膜囊泡中的 MRP2 转运蛋白测定中，还评估了 PT2385 和 PT2639。 未观察到 PT2385 的 MRP2 依赖性摄取 。然而，与不含 ATP 的囊泡相比，含有 ATP 的囊泡对 PT2639 的 MRP2 摄取量大约高 32 倍，表明存在主动运输。随着 PT2639 浓度的增加，表达 MRP2 的囊泡对 PT2639 的摄取量达到稳定水平，表明主动运输已达到饱和。 MRP2 抑制剂苯溴马隆 可消除 ATP 依赖性活性。因此, PT2639 是 MRP2 的底物，并且在较高浓度下 PT2639 可以使 MRP2 饱和。

最终, 提出了一个吸收模型来解释 PT2385 的肠道代谢（ 图 7 ）。口服后，PT2385 通过被动跨细胞扩散被肠细胞吸收。一小部分 PT2385 作为母体运输到血液中，而其余药物则被 UGT2B17 大量代谢形成 PT2639。然后 PT2639 可以遵循两种途径之一：吸收进入血液或主动 MRP2 介导运输到肠腔。一旦进入胃肠道，PT2639 就可以在细菌 β-葡萄糖醛酸酶的作用下转化为 PT2385，后者可以进行肠道重吸收，从而形成再循环。 PT2639 在犬中的 PK数据支持该模型, 给犬静脉 (iv) 和口服管饲 (po) 给药 PT2639 后，两种途径均产生了显著水平的 PT2385，并且口服给药比静脉给药产生的 PT2385 更多。

其中, UGT2B17、MRP2 和 β-葡萄糖醛酸酶单独发挥作用和协同作用。这三个成分的遗传多态性和不规则表达可能都在观察到的 PT2385 可变暴露中发挥作用。

5. 化合物设计和先导物优化

尽管模型很复杂，但 PT2385 的药代动力学问题可能都与肠道中 UGT2B17 将 PT2385 大量代谢为 PT2639 有关。因此，主要策略是减少葡萄糖醛酸代谢物的形成，同时保留 PT2385 的效力、选择性和药理学特性。

葡萄糖醛酸化 是人体药物代谢的重要途径。葡萄糖醛酸化通常是药物代谢的第二步，作用于氧化代谢产生的羟基化产物。然而，它也可以直接与含有羟基、羧酸、氨基或硫醇官能团的药物发生反应。葡萄糖醛酸化是一种由 UGT 酶催化的 S _N 2 反应，其中代谢药物或母体药物充当亲核试剂，PT2385 作为二级醇，辅因子 UDP-α-D - 葡萄糖醛酸 ( UDPGA, 4 ) 充当亲电试剂（ 图 8 ）。

图 8. PT2385 的葡萄糖醛酸化反应。

如图 9 所示，PT2385 的蛋白质抑制剂晶体结构揭示了两种关键的蛋白质-配体相互作用。PT2385 中的羟基与 Tyr281（结合水分子）和 His293 形成氢键网络。 HIF-2α 中的三个残基，Met252、His293 和 Tyr278 必须移动以适应这种氢键网络的形成。这些移动导致 HIF-2α 中的 Tyr278 与 ARNT 中的 Phe446 之间发生极为不利的空间冲突，从而导致 HIF-2α：ARNT 二聚体破坏并抑制 HIF-2α 转录活性。PT2385 中的吸电子甲基砜基团通过降低苯环的电子密度来增强结合亲和力。

由于羟基对二聚体破坏、细胞效力和物理特性的重要性，作者对第二代 HIF-2α 抑制剂的设计策略是保留羟基，但显著降低其在葡萄糖醛酸化中的反应性，从而提高药代动力学性能。 与未取代的类似物相比，茚满醇系列中的孪生二氟基团可使细胞效力提高 10 到 20 倍。推测 顺式 氟原子参与分子内 C–F···H–O 静电相互作用，从而降低配体结合所需的脱溶惩罚。 然而，高电负性的氟原子通过强诱导作用，也可能增加羟基部分在葡萄糖醛酸化反应中的反应性 。最终，对 核心茚满醇（ Indanols）的一系列 取代 发现了 化合物2 PT2639 和 化合物13 活性显著提高 （ 表 １ ）。

表 1. 核心茚满醇（ Indanols） 取代的 SAR

为了探索氟对葡萄糖醛酸化速率的影响，在 HIM 和UGT2B17 Supersomes™ ( 重组代谢酶系统) 中评估了 化合物 1、2、6-9 和 13 的稳定性 。 酶动力学参数 V _max 和 K _m 总结在 表 2 中。对于 PT2385，在 HIM 和重组 UGT2B17 中 V _max 值分别为 49 和 280 (pmol/min)/mg 蛋白质， K _m 值分别为 20 和 11 μM。 化合物 13 具有最高的葡萄糖醛酸化率( 最高 V _{max 值} 和最低 K _m 值 )。葡萄糖醛酸化率第三高的化合物是 化合物 8 。

在 化合物 2 和 7 中，仅保留了高效力，和低反应性的顺 式氟 原子。 化合物 2 和 7 产生葡萄糖醛酸代谢物的速度至少慢 20 倍。预计这两种化合物将提供更好的口服暴露量，并且对人类的影响更小。 此外， 化合物 2 中的 顺式 苄基氟进一步增强了药效。

表 2. 代表性化合物的酶动力学参数

6. PT2977 的体外药效和ADMET表征

在 HIF-2α 荧光素酶测定和 VEGFA 分泌测定中， PT2977 的效力强 2 至 3 倍（ 表 3 ）。 PT2977 的 log D _7.4 比 PT2385 低约 1 个对数单位。通常，用氟取代氢会略微增加亲脂性。然而，文献中已报道的例子表明氟化会降低分子亲脂性。 PT2977 极性的增加可能是由于靠近醇的氟原子与两个具有 顺式 构型的邻位电负性氟原子产生的高分子偶极子相结合所致。

亲脂性降低意味着血浆蛋白结合率显著降低。 在人血浆蛋白结合试验中， PT2977 的结合率比 PT2385 低约 30%（52% VS. 82%）。通过结合游离分数和细胞效力的改善，计算出 VEGFA 分泌试验中 PT2977 的游离分数调整 EC ₈₅ 为 75 ng/mL。 PT2977 在各种物种的微粒体和肝细胞中都是一种低清除率化合物，并且它在浓度高达 50 μM 时不会抑制 CYP P450 酶。

表 3. 抑制剂 PT2385 和 PT2977 的体外概况

7. PT2977 在临床前物模型的 PK

表 4 总结了静脉注射后 PT2977 的药代动力学特性。PT2977 在小鼠、狗和猴子中的血浆清除率 ( Cl _p ) 较低，在大鼠中的清除率中等。体内形成葡萄糖醛酸代谢物的可能性较低。

表 4. PT2977 在临床前物种中静脉给药后的 PK 参数

小鼠、大鼠、狗和猴子口服 PT2977 可获得良好的血浆暴露量。 图 11 比较了 PT2977 和 PT2385 的平均血浆浓度-时间曲线， 表 5 总结了母体和葡萄糖醛酸代谢物的药物暴露量 (AUC)。有趣的是，在啮齿动物中，PT2977 的口服暴露量仅略高于 PT2385，而这两种化合物在高等物种中的表现却截然不同。

PT2977 葡萄糖醛酸代谢物 ( PT3317 ) 在狗体内的 AUC 约为母体的 30%，而 PT2639 (PT2385 葡萄糖醛酸代谢物) 的 AUC 几乎比母体高 2 倍。对于 PT2385，狗药代动力学可以更好地预测人类体内葡萄糖醛酸代谢物 PT2639 的形成。因此，PT2977 在人体内的葡萄糖醛酸化倾向会降低，药代动力学特征有显著改善。

表 5. PT2385 与 PT2977 口服 PK 比较

8. PK/PD 关系和体内疗效

在皮下ccRCC 肿瘤的小鼠中进行了药代动力学/药效学 (PK/PD) 研究。口服 6 剂 PT2977 （0.3、1 和 3 mg/kg）或 PT2385 （10 mg/kg），每日两次。PT2977 有效且剂量依赖性地降低人类细胞周期蛋白 D1（受 HIF-2α 调控的靶基因）的 mRNA 水平（ 图 12 A ）。PT2977 在 1 mg/kg 时达到最大 PD 反应，而 PT2385 则需要更高的剂量 10 mg/kg。并且为了达到相同的 PD 效果， PT2977 的稳态谷血浆药物浓度约为 PT2385 浓度的 1/10 （ 图 12 B ）。化合物 PT2977 在体内的效力比 PT2385 高约 10 倍。以 0.3、1 和 3 mg/kg 的剂量 PT2977 均导致肿瘤快速消退（ 图 12 C ），证实化合物 PT2977 的体内活性优于 PT2385。 因此，PT2977 被选为第二代 HIF-2α 临床候选药物。

9. PT2977 的 1 期临床数据

在 1 期剂量递增试验中，晚期实体瘤患者接受 PT2977 治疗，剂量范围为 20 至 240 mg，每天一次，共 15 天（ 图 13 ） 。PT2977 的暴露量随剂量增加而增加，直至剂量达到 120 mg（ 表 6 ）。高于 120 mg 的剂量并未显著增加暴露量。 20 mg 剂量时达到目标稳态谷浓度 75 ng/mL，40 mg 及以上剂量时超过该浓度。

表 6. 每日口服一次 PT2977 的 PK 参数

如 图 14 A 所示，PT2977 治疗导致 EPO 表达快速且剂量依赖性降低。PT2977 120 mg qd 的 EPO 减少与 PT2385 高暴露患者的减少水平相当（ 图 14 B ）。PT2977 耐受性良好，贫血是与药理作用一致的最常见不良事件。第 1 期剂量递增研究中未达到最大耐受剂量 (MTD)。根据 PK、PD 和安全性数据，RP2D 确定为 120 mg qd。

图 15 A 显示 PT2977 和葡萄糖醛酸代谢物 ( PT3317 ) 的平均稳态血浆浓度随时间的变化。第 15 天，120 mg qd 剂量的 PT2977 的谷浓度 (24 小时) 为 500 ng/mL（代谢物/母体比为 0.32） 。对于 PT2385，需要 13 倍的总日剂量才能在 12 小时时达到 860 ng/mL 的谷浓度（代谢物/母体比为 6.0 ) 远高于 PT2977 ( 图 15 B )。除了效力和游离分数更高之外，PT2977 暴露更一致，没有暴露不足的患者( 图 16 )。

10. 讨论

本文研究了首创 HIF-2α 抑制剂 PT2385 在患者中的个体间 PK 变异性和低暴露量的潜在原因。根据循环代谢物鉴定和 UGT 表型分析，确定降低葡萄糖醛酸化速率将改善暴露量并降低患者中的变异性。

通过将 PT2385 中的一氟原子取代，可增强药效、显著降低亲脂性并大幅降低葡萄糖醛酸化。HIM 和 UGT 超体中的酶动力学研究揭示了氟取代和立体化学对葡萄糖醛酸化速率的影响。近年来，氟在现代药物化学和药物开发中的应用迅速扩展。 如2018 年 FDA 批准的 40% 以上的新化学实体 (NCE) 含有一个或多个氟原子。 该案例研究，强调了氟替代模式对内在效力、代谢物稳定性和药代动力学特性的重大影响。

参考: 10.1021/acs.jmedchem.9b0071９

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