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凝胶微球通过调节细胞与胞外基质相互作用增强脂肪源性间充质干细胞干性

BCML速递 · 公众号 · · 2024-09-02 22:00

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与传统的培养皿培养体系（ PDCS ）相比，凝胶微球培养体系（ GMCS ）为 MSC 的体外扩增和体内移植提供了更优良的平台。一方面，凝胶是一种以三维聚合物网络为特征的材料，能够容纳大量的水，其成分接近细胞外基质（ ECM ），可以为 MSC 提供一个仿生环境以保持其特性。另一方面，微球（ MS ）具有较大的比表面积，可以提供很高的空间利用率，弥补了 MSC 在 PDCS 中实现大规模扩增的困难。然而，与工程和材料科学的发展相比， GMCS 中的 MSC 生物学特性仍然局限于细胞粘附、增殖和分化。 GMCS 和 PDCS 中的 MSC 生物学状态差异仍不清楚，尤其是干性维持方面。因此，为进一步推动凝胶微球（ MS ）的应用，需要研究 GMCS 和 PDCS 中培养的 MSC 的生物学状态差异。来自浙江大学医学院附属第二医院的欧阳宏伟教授和沈炜亮教授构建了一种由明胶甲基丙烯酸酯（ GelMA ）构成的 “ 一体化 ”GMCS ，通过转录组和蛋白质组测序，揭示了在 “ 一体化 ”GMCS 和 PDCS 中培养的人脂肪间充质干细胞（ hADSC ）生物学状态的差异。扩增的 MSC 被诱导进行骨和软骨分化，构建用于骨软骨再生的双层支架。

研究中利用带 T 型接头的微流控技术制备了凝胶微球。微流控装置主要由压力发生器、压力控制器、储液器、 T 型芯片、紫外灯和收集器六部分组成（图 1a ）。通过压力控制器控制储液器中的压力可控制凝胶和油的流速。透明导管上的紫外光引发凝胶液滴的交联，随后被收集在收集器中，分离清洗后可用于细胞培养。利用微流控技术制备的凝胶微球形状规则，直径分布范围较小（图 1b 和 c ）。现有文献表明， 100 μm ～ 400 μm 的 MS 通常对细胞具有良好的性能，直径约 400 μm 的 MS 在体外表现出较高的细胞粘附和增殖率。因此，在 GMCS 中使用直径约 400 μm （ 387.84±19.23μm ）的微球。为了验证微流控制备的凝胶 MS 的细胞相容性，在凝胶 MS 表面培养了 hADSC 。接种 24 小时后，几乎所有细胞都粘附在凝胶 MS 上。从第 1 天到第 7 天，细胞存活率超过 95 ％（图 1d 和 e ）。培养 7 天后，细胞增殖约 3 倍（图 1f ），且观察到细胞极化呈纺锤体形状，这是 MSC 的典型形态（图 1g ）。这些结果表明凝胶 MS 具有良好的细胞相容性，适合 hADSC 扩增。

为了验证国际细胞治疗协会所述的 MSC 基本特性，我们随后对在 GMCS 和 PDCS 中培养 7d 的 hADSC 的表面标志表型、三向分化和集落形成能力进行了鉴定。流式细胞术结果显示，两组细胞均表达 MSC 特征性的表面标志（图 2a ）。它们阳性表达 CD105 、 CD90 和 CD73 ，阴性表达 CD45 和 CD34 。 GMCS 组细胞的集落形成能力明显高于 PDCS 组（图 2b 和 c ）。诱导后， GMCS 组细胞向脂肪、骨、软骨三分化潜能高于 PDCS 组（图 2d-g ），说明凝胶 MS 在维持 hADSC 表面标志表达表型的同时，提高了 hADSC 的三向分化能力和集落形成能力。利用转录组测序全面评估 hADSC 在 GMCS 和 PDCS 中扩增 7 天后的状况。主成分分析（ PCA ）显示两组细胞转录组存在差异（图 2h ）。在差异表达基因（ DEG ）热图中也观察到 GMCS 与 PDCS 组之间的基因表达存在显著差异（图 2i ）。与 PDCS 组相比， GMCS 组有 1454 个基因上调， 1795 个基因下调（图 2j ）。此外，基因本体（ GO ）富集分析表明， PDCS 组细胞更多地执行与细胞分化和组织发育相关的生物学过程，包括感觉系统、心脏、骨骼和软骨；而在 GMCS 组中，细胞富集的生物学过程主要与细胞分裂、核酸合成及细胞呼吸有关（图 2k ）。随后，研究者将两组的转录组测序结果与前期研究的体内脂肪祖细胞（ APC ）亚型转录组进行关联分析。结果显示， GMCS 组 APC 亚型与 hADSC 的相关系数明显高于 PDCS 组（图 2l ）。由于 APC 在 APC 中表现出最高的干性，因此检测到 APC 标志基因的表达。与 PDCS 组相比， GMCS 组 APC 标志基因（包括 CD55 、 PI16 和 SEMA3C ）的表达水平明显较高（图 2m ）。这些结果表明， GMCS 组的 hADSC 具有较高的干性，其转录组谱比 PDCS 组的更接近 APC 。

为了探究 hADSC 在 GMCS 中表现出高干性的机制，研究中进行了 KEGG 富集分析。在下调最多的前 20 条 KEGG 通路中， GMCS 组中 ECM- 受体相互作用通路下调最为显著（图 3a ）。在上调最多的前 20 条 KEGG 通路中， GMCS 组中核糖体通路上调最为显著（图 3b ）。基因集富集分析 (GSEA) 同样显示，在 GMCS 组中， ECM- 受体相互作用相关基因呈下降趋势（图 3c ），而核糖体相关基因呈上升趋势（图 3d ）。差异表达蛋白（ DEP ）中与细胞 -ECM 相互作用相关的蛋白质热图也显示，与 PDCS 组相比， GMCS 组中与细胞 -ECM 相互作用相关的蛋白质，包括胶原蛋白、整合素、纤连蛋白和层粘连蛋白均下调（图 3f ）。

研究中推测 GMCS 中 hADSC 的干性可能受细胞 -ECM 相互作用调控。因此，他们通过可溶性 RGD 抑制在 PDCS 中培养的 hADSC 的细胞 -ECM 相互作用。抑制 7 天后，与正常培养组相比，细胞表现出更高的三系分化能力（图 4a-d ）。抑制细胞 -ECM 相互作用也能提高细胞的集落形成能力（图 4e 、 f ）。与正常培养组相比，抑制组 APC 标志基因 CD55 ， PI16 和 SEMA3C 的表达水平明显升高（图 4g ）。接着，研究者在 GMCS 组中使用 RGD 修饰的凝胶 MS 来增强细胞与 ECM 的相互作用。培养 7 天后，与 GMCS 组相比， GMCS+RGD 组的细胞表现出更高的三系分化能力（图 4h-k ）和集落形成能力（图 4l 和 m ）。此外， GMCS+RGD 组的 APC 标志基因的表达水平也高于 GMCS 组（图 4n ）。上述结果表明，在不同培养体系中，干细胞特性与细胞 -ECM 相互作用的关系不同，在 PDCS 中，可通过下调细胞 -ECM 相互作用来提高 hADSC 的干细胞特性；而在 GMCS 中，可通过上调细胞 -ECM 相互作用来提高 hADSC 的干细胞特性。

为了进一步比较 GMCS 与 PDCS 体系中 hADSC 在组织工程中的应用性能，研究者采用两个体系中常用的方法制备骨软骨双层支架（图 5a ）。通过圆柱形模具控制 GMCS 和 PDCS 组骨软骨支架直径为 4 mm （图 5b ），通过调节 GMCS 组凝胶 MS 或 PDCS 组凝胶的体积将支架高度控制在 1.5 mm 。活 / 死染色显示两组支架内细胞分布均匀（图 5c ）。 RT-PCR 结果显示， GMCS 组骨支架中成骨基因（ OCN 、 COL I ）和软骨支架中成软骨基因（ ACAN 、 COL II ）的表达水平均高于 PDCS 组（图 5g 、 h ）。免疫荧光染色结果也显示， GMCS 组骨支架中骨相关蛋白和软骨支架中软骨相关蛋白的表达均明显高于 PDCS 组（图 5i-l ）。前期研究发现，在中等硬度基质中同时加入诱导培养基培养的 MSC 比在软基质和硬基质中培养的细胞更容易分化为骨。此外，杨氏模量测试结果显示，无论是骨支架还是软骨支架， GMCS 组的力学性能均高于 PDCS 组（图 5d-f ）。

最后，研究中采用凝胶黏附骨与软骨支架构建骨软骨双层支架修复骨软骨缺损（图 6a ）。细胞骨架染色结果显示，骨和软骨支架内细胞分布于黏附层两侧，形成双层支架（图 6b ）。随后将双层支架植入新西兰大白兔骨软骨缺损内，分别于 4 、 8 、 16 周后取样。大体观察结果显示， GMCS 组第 4 周缺损已有明显修复，第 16 周大部分缺损已修复（图 6c ），而 PDCS 组及空白对照组第 4 周缺损基本未修复，第 16 周样本仍有大面积组织损伤。显微 CT 结果显示， GMCS 组的新骨组织形成量明显多于 PDCS 组和对照组（图 6e ）。第 16 周， GMCS 组的缺损几乎完全被新生骨组织覆盖，而 PDCS 组和对照组分别只有约 1/2 和 1/4 的缺损被再生骨组织覆盖（图 6e ）。通过显微 CT 获得的定量数据显示，与 PDCS 组和对照组相比， GMCS 组的骨面积显著增加，尤其是在移植 16 周后（图 6f ）。从第 4 周到第 16 周， GMCS 组的骨体积和骨矿物质密度均显著增加，而 PDCS 组和对照组之间没有明显差异（图 6g 和 h ）。

综上所述，该研究揭示了人脂肪干细胞在 GMCS 和 PDCS 中培养的生物学状态差异。结果表明，在 GMCS 中培养的人脂肪干细胞通过调控细胞 -ECM 相互作用表现出更高的三向分化潜能、克隆形成能力和干细胞特性。此外， GMCS 组的双层支架对骨软骨再生的效果优于 PDCS 组。对细胞行为和机制的探索可以加深我们对凝胶 MS 生物学优势的理解，从而进一步促进凝胶 MS 在生物医学领域的应用。

本研究由浙江大学医学院附属第二医院欧阳宏伟教授和沈炜亮教授研究团队合作完成，并于 2024 年 5 月 18 日在线发表于 Biomaterials 。

文章信息： He Q, Liao Y, Zhang H, Sun W, Zhou W, Lin J, Zhang T, Xie S, Wu H, Han J, Zhang Y, Wei W, Li C, Hong Y, Shen W*, Ouyang H**. Gel microspheres enhance the stemness of ADSCs by regulating cell-ECM interaction. Biomaterials 2024, 309:122616.

供稿：季威

审校：孙亨

编辑：许梦平