在肿瘤免疫治疗中嵌合抗原受体转导的NK细胞

天然杀伤（NK）细胞是基于细胞的癌症免疫治疗中的潜在效应细胞，特别是在控制血液恶性肿瘤中。 NK细胞免疫疗法的初步研究是使用由白介素-2（IL-2）活化的自体NK细胞。然而，这种方法临床效果较差，主要是由于自体NK的抑制，因为自身白细胞抗原（HLA）分子呈递的肿瘤细胞上的配体与NK细胞上的杀伤细胞抑制受体（KIR）结合。由于“缺少自我”识别肿瘤细胞，同种异体或相似的NK细胞与KIR配体失配的转移避免了这种抑制。因此，同种异体NK细胞输注是安全的，可以消除白血病复发而不导致移植物抗宿主病（GVHD）。然而，治疗过继NK从外周血（PB）中纯化的细胞由于这些细胞在体内的寿命短（通常几天至几周）而受到限制。最近的研究已经表明，细胞因子可以诱导NK细胞成为记忆NK细胞，其在体内具有更长的寿命。通过简单的用IL-12，IL-15和IL-18预先激活细胞，记忆NK细胞在体外和体内，分化并表现出对白血病细胞的增强的IFN-γ产量和细胞毒性。在I期临床试验中观察到临床反应中，九名急性骨髓性白血病患者中有五人，包括四个完全缓解。重要的是，IL-15刺激的NK细胞输注在实体瘤治疗中显示出有希望的治疗功效。具体来说，在接受单倍体干细胞移植，6名具有难治性实体瘤的儿科患者中有4例显示临床反应，特别是一名具有非常好的缓解的患者和两名部分缓解患者。

嵌合抗原受体（CAR）是基于T细胞受体的人工修饰融合蛋白，其由与各种细胞内信号转导域融合的细胞外抗原识别结构域组成。CAR的细胞外结构域通常是识别特异性抗原的抗体单链可变片段（scFv），其通过与抗体相似的主要组织相容性复合物（MHC）分子而不存在特异性抗原（通常在肿瘤细胞上过表达或独特的）。细胞内结构域通常包含CD3ζ，CD28，4-1BB或OX40，用于增加T细胞活化。遗传修饰以表达CAR的T细胞可以直接识别CAR靶向的抗原，然后触发表达CAR特异性抗原的肿瘤细胞的T细胞活化，增殖，细胞因子分泌和细胞毒性。因此，CAR修饰的T细胞治疗在治疗血液癌症，包括淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病（ALL）方面取得了显着的成功。据报道，CD19靶向CAR-T细胞在所有患者中具有70％至90％的完全缓解率。然而，CAR修饰的T细胞表现出较差的治疗实体瘤的疗效。此外，由于同种异体T细胞引起的GVHD，CAR-T细胞的制备通常需要患者自体细胞，这限制了其更广泛的临床应用。此外，体内CAR-T细胞的扩增和持续性可能诱导促炎细胞因子的释放，称为细胞因子风暴或细胞因子释放综合征（CRS）。

与CAR表达的T细胞相似，在体内和体外，CAR修饰的NK细胞表现出改善的肿瘤特异性靶向和细胞毒性.NK细胞与CAR靶向免疫治疗中的T细胞相比具有许多优点。例如，同种异体NK细胞可用作效应细胞，因为它们不需要HLA匹配，不会引起GVHD。此外，CAR-NK细胞可能比CAR-T细胞更安全，因为他们通常不会诱导细胞因子风暴。另外NK细胞可以从不同的来源产生，如PB，脐带血（UCB），人类胚胎干细胞（hESCs），诱导的多能干细胞（iPCS），甚至是NK-92细胞系。本次，我们将重点介绍CAR修饰的NK细胞免疫治疗的最新进展，在临床和临床环境中使用CAR工程化NK细胞进行肿瘤治疗的优势和当前进展，将CAR工程NK细胞翻译成临床实践的主要障碍，以及增强安全性的新策略，CAR表达NK细胞的功效。

尽管CAR-T细胞疗法早期成功，特别是在血液恶性肿瘤中，CAR-T细胞治疗的大规模临床应用可能受个体化制剂和各种副作用（如CRS，神经系统毒性和靶向/肿瘤外效应）的限制。鉴于这些问题，NK细胞已经被提出为T细胞的优良CAR驱动剂。 具体来说，与T细胞相比，NK细胞在基于CAR的免疫治疗中具有几个优点。

首先，CAR表达的NK细胞可能比CAR-T更安全。临床使用细胞，以及NK细胞免疫治疗的安全性已在多个临床领域得到验证。例如，III期I / II期试验显示，同种异体NK细胞输注耐受性好，不会导致GVHD和严重的毒性;因此，NK细胞是不限于自体细胞的通用CAR驱动器。 CAR-T细胞治疗的主要副作用之一是由于靶向/脱离肿瘤的作用CAR-T细胞的持续性。例如，由于T细胞的细胞记忆反应和正常成熟或祖细胞B细胞的侵袭，CD19靶向CAR-T细胞可导致深刻和持久的B细胞缺陷。幸运的是，CAR-NK细胞在循环中的使用寿命有限，导致了很少的靶向/非肿瘤效应。此外，由NK细胞产生的细胞因子的类型与由T细胞产生的细胞因子不同;活化的NK细胞通常产生IFN-γ和GMCSF，而CAR-T细胞诱导的细胞因子风暴主要由促炎细胞因子如TNF-α，IL-1和IL-6介导。

第二，除了通过CAR特异性杀死靶细胞机制（通过scFv识别肿瘤相关抗原），NK细胞可以通过识别各种激活受体（包括天然细胞毒性受体（NKp46，NKp44和NKp30，NKG2D和DNAM-1）的多种配体，自发杀死肿瘤细胞（CD226）。这些活化的NK细胞受体通常识别在免疫细胞的压力下在肿瘤细胞上表达的应激诱导的配体或长期治疗肿瘤。此外，NK细胞通过FcγRIII（CD16）介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。因此，CAR-表达NK细胞可以通过CAR依赖性和NK细胞受体依赖性机制来杀死靶细胞，以消除肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞或表达NK细胞受体配体的肿瘤细胞。实际上，临床试验表明，CAR-T细胞不能根除高度异质性的肿瘤细胞，而CAR修饰的NK细胞可以有效地根除长期治疗后可能改变其表型的残留肿瘤细胞。

最后，NK细胞在临床标本中丰富，可以由PB，UCB，hESCs，iPCSs甚至NK-92产生细胞系。NK-92细胞提供均匀的细胞群，并且可以在良好的实践标准下容易扩展，用于更广泛的临床应用，CAR修饰的NK-92细胞的“现成”生产。然而，由于其肿瘤细胞系来源，它们必须在输注之前照射。活化的PB-NK细胞表达更广泛的活化受体并可以不用照射，这允许它们在体内扩张。源自iPSC或hESC的NK细胞结合了PB-NK和NK-92细胞的优点，因为它们表现出与PB-NK细胞相似的表型，并且是均质的群体。重要的是，CARs可以使用非病毒基因转移方法在hESC和/或iPSC衍生的NK细胞中很容易地表达。

合适的CAR结构对于激活CAR转导的细胞很重要。大多数CAR-NK细胞使用含有CD3ζ作为细胞内信号结构域的第一代CAR构建体或第二代CAR结构，其表达第二信号结构域（例如CD28，4BBB）与CD3ζ （图1） 。一般来说，NK细胞中的第二代CAR较第一代更为活跃。一些基于NK细胞的激活特征的研究设计了CAR构建体。例如，DNAX激活蛋白12（DAP12）和DAP10已经被选择为细胞内信号结构域，而对于NK细胞，CD3ζ似乎是比DAP10更好的信号转导域，而DAP12可以更好地激活信号而不是CD3ζ。对于第二代CAR，重要的共刺激分子4-1-BB与CD3ζ作为胞内结构域结合，其显着增强CAR-NK细胞的靶向裂解。然而，用于最佳NK细胞活化的CAR构建体的组合取决于肿瘤类型或靶抗原。基于NK细胞活化受体NKG2D对NK细胞活性的重要性和NKG2D配体在不同肿瘤上的常见的过表达，已经将包含NKG2D作为胞外域，并将DAP10和CD3ζ作为关键信号分子的独特的CAR构建体。这些CAR表达的NK细胞对广泛的肿瘤亚型表现出增强的细胞毒性，在骨肉瘤，前列腺癌和横纹肌肉瘤中观察到最好的反应。

通常在缺乏几乎所有类型免疫细胞的NSG或NOG（NOD / scid / IL-2Rγnull）小鼠中评估CAR-NK细胞的安全性和有效性。为此，将肿瘤细胞系α或患者来源的肿瘤异种移植物（PDX）植入NSG或NOG小鼠中以建立人肿瘤模型。细胞系衍生的肿瘤异种移植物模型很简单但不能捕获原始肿瘤的异质性。通过将原发性肿瘤直接从患者转移到免疫缺陷小鼠中建立的PDX模型可以保留原发肿瘤样品的异质性，并且更加类似于早期建立的细胞系和标准异种移植物的原始临床病理。因此，这种模式已经成为有力的工具肿瘤异种移植物。大多数CAR-NK细胞被转移到PDX模型中以评价其在临床前试验中的安全性和功效，包括来自血液学癌症（例如CD19，CD20，CD138和CS-1）的CAR靶向抗原和实体瘤（例如HER2，EpCam，GD2，GPA7，PSCA，EGFR和EGFRvIII） （表1） 。

然而，NSG和NOG小鼠的免疫系统缺陷阻止了免疫系统的变化，免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用，重要的是CAR-NK或CAR-T治疗对肿瘤宿主免疫细胞的微环境影响。人源化小鼠由于将人类造血干细胞转入免疫缺陷小鼠而发育出功能性的人类免疫系统，用于缩小肿瘤微环境的差距。迄今为止，人源化小鼠已被用于评估某些CAR-T细胞疗法的安全性和有效性。例如，将CD44v6靶向的CAR-T细胞转移到造血重建的NSG异种移植小鼠中以评估正常造血干细胞上的靶向/脱离肿瘤毒性。用人源化小鼠模型评估人类抗碳酸酐酶IX（CAIX）靶向用于分泌人抗编程性死亡配体1（PD-L1）抗体的CAR-T细胞的组合免疫治疗对T细胞衰竭的逆转和促进NK细胞募集到肿瘤部位的作用。总体而言，人源化的老鼠更精确基于CAR的免疫治疗临床前试验模型。

尽管对CAR-T细胞进行了大量的临床试验，但只有少数临床试验检测出CAR转导的NK细胞正在作用，包括CAR修饰的NK-92和原代NK细胞（表1）。由PersonGen BioTherapeutics（中国苏州）发起的四项临床研究旨在评估CAR修饰的NK-92细胞对复发性或难治性恶性肿瘤患者（包括白血病，淋巴瘤和实体瘤）的安全性和有效性。淋巴瘤和白血病的靶点包括CD19，CD7和CD33，而MUC1靶向复发性或难治性实体瘤，包括肝细胞癌，非小细胞肺癌，平底腺癌，三阴性浸润性乳腺癌，结肠直肠癌和胃癌的恶性胶质瘤。虽然NK-92细胞系已经成功进入临床试验，但其临床应用受到安全性差和体内扩张和持续性差的限制，因为这种细胞系必须在输注前照射，并表达较少的天然NK细胞受体。

三项临床试验着重于表达CD19特异性CAR用于治疗B系的人类原代NK细胞。第一次试验（NCT00995137）在圣朱德·奇尔丹研究医院进行，第一期已经完成。在该试验中，使用照射的K562细胞系以表达膜结合的IL-15和4-1BB配体（K562-mb15-41BBL）作为饲养细胞，以在转导CD19靶向之前促进供体NK细胞的扩增CAR（抗CD19-BB-zeta）。第二次临床试验（NCT01974479）使用了类似的方法来扩增NK细胞。具体来说，用抗CD19-BB-zeta mRNA转染原代NK细胞以构建CD19靶向的CAR-NK细胞。第三次试验（NCT03056339）使用iC9 / CAR.19 / IL15转导的UCB衍生的NK细胞，并由MD安德森癌症中心赞助。含有作为信号结构域的CD28 /CD3ζ，作为自杀基因的诱导型半胱天冬酶-9（iCasp9）和作为活化细胞因子的IL-15的CAR被转导入UCB衍生的NK细胞。该阶段I / II试验最近于2017年批准用于B淋巴细胞恶性肿瘤。

原发性CAR-NK细胞的体外扩增

CAR-NK细胞临床应用的首要挑战是CAR修饰的原代NK细胞的离体扩增。近年来，临床级NK细胞的纯化/扩增主要集中在PB，脐带血和胚胎干细胞产生。虽然通过与照射的K562-mb15-4-1BBL细胞作为饲养细胞共培养，临床级原发性NK细胞的扩增是实用的，但关于最终NK产品中残留饲养细胞的保留仍然存在。在用重组人IL-15加4-1BBL + IL-15Rα+ K562细胞作为饲养细胞共培养的过继转移供体来源的IL-15 / 4-1BBL激活的NK细胞（aNK-DLI）的临床试验中，3例患者观察到4级GVHD。因为aNK-DLI是HLA匹配的，并且T细胞耗尽，这是低风险的严重的GVHD，饲养细胞的利用可能对观察到的GVHD有影响。

在无饲养条件下，人NK细胞的扩增，例如来自具有细胞因子（IL-2或与IL-15或抗CD3mAb组合的）的PBMC的原代NK细胞的扩增，目前是可行的并且是安全的。由于PBMC含有低水平的NK细胞，其浓度为5％-20％，Koehl等人使用免疫磁珠从CD56细胞中纯化NK细胞扩增，然后这些细胞随后在体外通过IL-2激活12天。这种方法导致中位数为7.59×108 CD56 + CD3-细胞，其显示出94％的纯度和生存力。然而，从纯化的CD56 +细胞扩增的NK细胞的量是有限的，并不足以用于CAR-NK细胞治疗。因此，Sutlu等人直接从PBMC扩增NK细胞，没有任何分离策略，在21天后获得9.8×109个NK细胞的平均值，但是这些细胞的纯度仅为38％。最近，Masuyama等人报道了一种获得高纯度NK细胞的新方法。具体来说，用抗CD3和抗CD52单克隆抗体共刺激PBMC，并在具有自体血浆和IL-2的NKGM-1培养基中培养14天。使用这种方法，NK细胞的纯度在培养7天后约为60％，而这种纯度在持续培养中高得多。在14天培养后，从20mL PB（增加约646倍）产生5.7×109个NK细胞的中位数。最近的研究表明，IL-12，IL-15和IL-18的短暂预激活，随后用这些细胞因子连续刺激和扩增诱导在体内显示更长寿命的记忆NK细胞。这些记忆样NK细胞在过继转移后表现出增强的IFN-γ产生和细胞毒性以及良好的临床反应。因此，这种方法显示出对NK细胞扩增的巨大前景。在未来，扩大天然NK细胞或记忆样NK细胞的选择需要基于临床反应。

Spanholtz等人开发了一种基于细胞因子的方法，不需要从UCB扩增人NK细胞的支持性给药物。具体来说，他们使用两步体外差异化方案，使用一种新的临床级培养基，其包含不同的细胞因子组合（包括SCF，IL-7，Flt3L，TPO，IL-15，G-CSF，GM-CSF ，IL-6，IL-2等），从体外从CD34 + UCB细胞产生高纯度的扩增的CD56 + NK细胞。平均膨胀大于15 000倍，纯度接近100％。重要的是，用这种方法产生的UCB衍生的NK细胞表现出强大的功能，它们可以有效靶向骨髓性白血病和黑素瘤细胞系。因此，如果可以克服使用UCB作为源的限制，这种方法是理想和实用的。UCB衍生的CAR-NK细胞治疗B淋巴细胞恶性肿瘤（由MD安德森癌症中心主办）最近一直在批准临床试验（NCT03056339）。

来自hESC或iPSC的NK细胞的临床基于两步培养系统，其以异种基质细胞的方式，利用基于重组蛋白的无动物产物培养基。简而言之，首先使用“旋转胚状体”的方法用未破裂的hESCs和iPSC（EB）方法通过11天产生造血祖细胞的，没有分选，然后将自旋EB直接转移到含有细胞因子（IL-3，IL-7，IL-15，SCF和Flt3L）的限定条件下，无外源基质细胞并培养28-35天。hESCs或iPSCs的利用可能会避免使用UCB作为来源的限制，但问题仍然存在，例如选择最佳细胞系（hESCs或iPSCs）来扩增NK细胞和发展自身来源UCB，hESCs或iPSC的NK细胞的耐受性。

CAR转导NK细胞的方法

另一个紧迫的障碍是选择表达CAR的NK细胞的合适的转导方法。已经应用两种转导方法来引入CAR：病毒载体和非病毒载体。

对于病毒载体，逆转录病毒或慢病毒载体主要用于遗传工程化的原代CAR-NK细胞，因为它们能稳定地整合到基因组中。扩增的原代NK细胞中逆转录病毒载体的转导效率非常高，即中位数为69％（43％-93％），但是该方法存在由于稳定的转基因表达引起的插入突变，肿瘤发生或持续和不受控制的风险。例如，一份报告显示，接受复发型病毒介导的基因治疗的9名患者中有4名发展为T细胞白血病。慢病毒载体具有中等程度的插入突变，但是对于PBα衍生的NK细胞，其慢病毒转导效率非常低（在8％-16％之间）。然而，脐带血来源的NK细胞的传导效率达到73％，这足以将CAR引入脐带血来源的NK细胞。然而，PB衍生的NK细胞的慢病毒转导效率需要改善。

由于插入突变的高风险和用于临床治疗的病毒载体的高成本，非病毒载体已经越来越受到关注。非病毒载体如裸DNA具有一些优点，例如它们便宜且免疫原性低，但不能将trans基因整合到基因组中。非病毒睡美人（SB）转座子系统是一种替代的基因转移系统，结合病毒和非病毒载体的优点，因为它们介导稳定的转基因表达。SB转座子系统经由双组分载体系统转运基因，该双组分载体系统由含有目的基因（例如，CAR）的转座子组成，其侧翼为反向末端重复序列，以及与反向末端重复序列结合的转座酶（例如SB100X）切割和粘贴“转座子整合到基因组中。几组已经使用电穿孔成功地将SB转座子系统应用于T细胞中的CAR转基因。已经发起了I期试验，使用SB产生用于治疗患者的CD19特异性CAR-T细胞晚期非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病，其在自体或同种异体环境中接受HSCT和CAR-T细胞输注作为辅助治疗。结果确定84％CAR表达没有积分热点。重要的是，自体HSCT后30个月的进展期自由和总体生存率分别为83％和100％，12个月后12个月的比例分别为同种异体HSCT后的53％和63％。但是，由于低转染效率和电穿孔DNA载体对原代NK细胞的严重细胞毒性，SB转座子系统将CAR转基因转导入原代NK细胞的适用性仍然是未知的。然而，SB转座子系统已经被证明可以介导脐带血衍生的造血干细胞和祖细胞中的基因转移细胞和基于SB的抗CD19 CAR转基因已经在后续研究中成功测试。因此，从UCB造血干细胞和祖细胞扩增CAR-NK细胞可能是可行的，然后使用SB转座子系统遗传转移CAR。

已经在人类原代NK细胞中测试了使用电转化编码CAR的mRNA的转染。mRNA的电穿孔是瞬时表达CAR的安全，经济高效和有效的方法。Shimasaki等人表示61.3％的细胞表达抗CD19 CAR，并且在电穿孔后24小时扩增的NK细胞的活力达到90％。值得注意的是，mRNA电穿孔与转染效率相关，80％-90％不仅在体内扩增的细胞，同时也在（非细胞因子激活的）人NK细胞中。 然而，由于通过mRNA电穿孔（至多3天）转移的CAR的瞬时表达，抗肿瘤作用也可能是短暂的，并且通过电穿孔mRNA制备的CAR-NK细胞可能更适合作为快速降低肿瘤的辅助治疗细胞负担。