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国自然
作者：Lucky King
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今天讲的文献题目是“
一组MicroRNA作为鉴定前列腺癌的诊断性生物标志物
”，这是一篇干湿结合的小文章，影响因子3.226（回复
170718
可下载文献，一周有效）。
将患者（n=28）与对照（n=12）的病理数据、特征进行比较（表1）。
在诊断早期阶段、治疗前阶段，给患者取血。（Blabla。。。一大段临床病人筛选，此处省略一万字母）。
收集血液，从样本材料中提取miRNA。HTS数据显示，在miRBase中存在2588个miRNA，采集的样品中处于可检测到水平的miRNA约550个。为了更好地完善、不遗漏miRNA名单，使用Benjamini-Hochberg方法对p值进行调整，从而产生了False检测率、FDR值。FDR值表示使用广义线性化模型可能的错误检测率。
为了在HTS数据库中筛选出尽可能多的miRNA，FDR值<0.2的都被选中。FDR值为0.2意味着：选定的miRNA中20％可能是假阳性。作者后期还将使用qRT-PCR进行验证，所以初期使用HTS数据库时多选择了些miRNA。HTS数据库显示，差异表达失调的top 10 miRNA见表2。
由于miR-5582-3p和miR-543引物难合成，且样本中丰度低，所以舍弃了。另外miR-500b-3p其丰度也较低，舍弃。最终确定7种microRNA进行下步分析。
使用生物信息学分析，患者和对照组的HTS总读数没有显著差异，表明来自正常组和患者组的血液中含有相似量的总miRNA（图1）。作者认为，miRNA总量的相似可以证实某些miRNA的差异表达不是由于文库大小的差异引起的。
使用R程序，Trimmed Mean of M-values加权截断均值（TMM）法进一步处理原始数据。随后通过qRT-PCR证实了TMM方法对miRNA测序结果正常有效。
由HTS差异表达分析表明：七个失调的miRNA，对照组和患者组之间的归一化读数差异很大（图2 a-g）。患者血液样品中4种miRNAs（miR-127-3p、miR-204-5p、miR-329-3p、miR-487b-3p）上调（图2 a-d），而3种miRNA（miR-32-5p、miR-20a-5p、miR-454-3p）被下调（图2e-g）。
为了确认HTS数据的准确性可用性，使用qRT-PCR进行验证。以确保miRNA表达异常是由于真正的生物学变异而不是技术性错误。（原文过于洋气&啰嗦，就是验证）。
使用 NormFinder （NormFinder software）程序分析结果，该程序检查组内和组间差异以确定每个miRNA的稳定性值。值越低，越好。
NormFinder程序选择出8个稳定表达的miRNA：miR-146a-5p、miR-1538、miR-197-3p、miR-1468-3p、miR-26b-5p、miR-296-5p、miR-1248和miR-23a-3p（图3a）。
NormFinder筛选建议：单一最佳选项是miR-146a-5p。当没有突出的单一选项时，NormFinder建议使用miRNA组合来增加可靠性，并减少组内和组间差异性。
由于前四个miRNAs（miR-146a-5p、miR-1538、miR-197-3p、miR-1468-3p）均显示出非常接近的稳定性值，将每个miRNA的值、Top2（miR-146-5p和miR-1538）组合平均值、所有top 4的miRNA组合的平均值进行比较。
Top2组合显示组内变化减少，特别是对于患者组。Top4 miRNA组合的平均值，在对照组和患者组之间均显示出更小的内部变化（图 3b最后一组）。因此，选择top4 miRNA组合作为标准化用于下步qRT-PCR分析。
（这一大段是方法论，证明方法有理有据有效，可用于后续。这里的一堆miRNAs和前列腺癌一毛钱关系都木有。）
