实验干货 | 不同细胞的冻存液配制比例

在现代生物医学研究中，细胞冻存技术已经成为一种不可或缺的手段。通过将细胞在超低温环境中保存，研究人员能够长期保存珍贵的细胞系，确保其生物学特性不变，并在需要时随时复苏使用。然而，不同类型的细胞对冻存液的需求各不相同，合理的冻存液配制比例对于细胞的存活率和功能保持至关重要。

冻存液通常由基础培养基、保护剂（如二甲基亚砜，DMSO）和血清等成分组成。基础培养基提供细胞所需的营养，保护剂则通过降低冰晶形成的风险来保护细胞膜和细胞器，而血清则提供额外的生长因子和保护作用。

不同细胞类型对这些成分的需求比例有所不同。例如，哺乳动物细胞通常使用10%的DMSO和90%的培养基，而某些敏感的干细胞可能需要更高浓度的血清来提高存活率。

此外，冻存过程中的降温速率也是影响细胞存活的重要因素。一般来说，缓慢降温（约每分钟1°C）有助于减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞的复苏率。快速降温则可能导致细胞损伤，降低存活率。因此，针对不同细胞类型，研究人员需要根据其特性调整冻存液配制比例和降温速率，以达到最佳的冻存效果。

总之，了解和掌握不同细胞的冻存液配制比例，不仅有助于提高细胞的存活率和功能保持，还能为后续的研究工作提供可靠的细胞资源。这一领域的研究不断深入，未来将为生物医学研究带来更多的可能性和突破。

细胞冻存液是用于在低温环境下保存细胞的一种特殊溶液，其主要目的是保护细胞在冷冻和解冻过程中免受损伤。细胞冻存液通常包含渗透性和非渗透性保护剂，如二甲基亚砜（DMSO）和甘油，这些成分可以渗透到细胞内部，降低细胞内外的电解质浓度，防止细胞内水分外渗，从而减少冰晶的形成。

此外，细胞冻存液中还可能含有血清或其他蛋白质，以提供额外的保护和营养。传统的细胞冻存液配方通常是培养基、血清和DMSO按一定比例混合，其中DMSO的含量一般为10%。在使用过程中，细胞冻存液需要提前配制，并通过程序降温的方法逐步降低温度，以确保细胞的存活率和功能不受影响。近年来，不含血清和DMSO的细胞冻存液也逐渐被开发出来，以减少潜在的污染和毒副作用。

细胞冻存是实验室中至关重要的技术之一，而正确配制冻存液是确保细胞在冻存过程中存活的关键。根据不同细胞系的特性和存活需求，冻存液的配比也会有所不同。一般而言，常用的细胞冻存液配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，适用于多数细胞系，能够保证细胞在冻存过程中有较高的存活率。

对于那些需要长时间保存或者具有特别珍贵性的细胞系，可考虑调整冻存液中的成分比例。增加冻存液中的血清浓度可以提高细胞的营养来源，在维持细胞活性方面起到积极的作用。一种常见的调整是将血清和DMSO的比例调整为9:1，这样可以更好地保护细胞，并确保其在冻存后依然保持较好的生物学特性。

因此，在进行细胞冻存实验时，根据具体细胞系的特性和所需保存时间的长短，科学合理地选择和配置冻存液配比是非常重要的，可以有效提高细胞的存活率和保存质量。

2.不同细胞冻存液配置比例

根据ATCC官网推荐的细胞冻存液配置比例表格，可以看出大部分细胞并不需要高比例的血清，只需使用含有10%血清的完全培养基来配置成含5% DMSO 的溶液即可用于细胞冻存，有的甚至无需加入血清。这引发了一个有趣的问题，为什么其他销售细胞的厂家在配备细胞说明书中都强调需要添加高比例血清，比例也比ATCC官网推荐的高呢？

实验人员都知道，当前市场上无血清细胞冻存液非常流行，许多实验室使用无血清细胞冻存液主要是因为相对于自配冻存液更加方便快捷（无需梯度冻存），且价格不高，特别适用于那些需要高比例血清的细胞系。

然而，微商标明的无血清细胞冻存液说明书中除了列明的成分如酚红和 DMSO 外，并未具体说明其他成分组分，其外观几乎都是无色透明的。因此，除了已知成分外，这些液体还含有什么成分呢？大家可以尝试猜测，也可以进行实验验证猜想。曾有实验室尝试将自配的冻存液直接存放在 -80°C（不执行梯度冻存），结果并未发现明显影响。

因此，细胞冻存液配制中的血清比例确实存在差异，而使用无血清细胞冻存液则成为了一种方便实用的选择，尤其适用于那些血清需求高的细胞系。

细胞冻存液的配置是细胞保存过程中非常关键的一步，主要目的是在低温条件下保护细胞免受冰晶形成和渗透压变化的损伤。以下是详细的配置方法和注意事项：

• 配置方法

• 二甲基亚砜 (DMSO)：一种渗透型细胞保护剂，常用浓度为5-10%。
• 胎牛血清 (FBS)：提供营养和保护细胞，常用比例为20-90%。
• 培养基：如DMEM或1640培养液，提供细胞所需的基本营养。

常见配方：

• 配方一：70% 1640培养液 + 20% FBS + 10% DMSO。
• 配方二：90% FBS + 10% DMSO。

步骤：

• 细胞准备：将细胞培养至对数生长期，去除旧培养液，用PBS清洗细胞。
• 消化细胞：加入适量胰酶消化细胞，终止消化后离心收集细胞。
• 配制冻存液：根据细胞类型选择合适的配方，混合DMSO、FBS和培养基。
• 重悬细胞：将细胞重悬于配制好的冻存液中，调整细胞浓度至5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL。
• 分装冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，每管1-1.5mL，做好标识。

• 程序降温：使用程序降温盒，-80℃过夜，然后转移至液氮中长期保存。

在冻存液配置过程中，一些注意事项需特别留意。首先，DMSO 在使用时无需经高压灭菌处理。其次，为了保证冻存液的有效性，建议使用新鲜的 DMSO，并避光保存以避免可能的降解。

另外，在进行冻存前的准备工作也至关重要。应先将对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后进行离心，去除残留的胰蛋白酶。随后，将细胞悬液与配制好的冻存液混合，调整细胞浓度至适宜的范围（通常为 5×10^6 至 1×10^7 细胞/ml）。随后，将调整好的细胞悬液分装至冻存管中，每管容量约为 1-1.5 ml。最后，按照标准程序将冻存管放置至液氮中进行长期保存。

上述冻存液配置过程中的几点注意事项，包括正确处理 DMSO、使用新鲜冻存液、细胞预处理和适当的分装和保存方法，将有助于最大限度地保障细胞在冻存过程中的质量和存活率。

在配置细胞冻存液时，有一些关键的注意事项需要牢记，以确保细胞在冷冻和解冻过程中的存活率和功能不受影响：

• 提前配制冻存液：冻存液应提前配制并冷却，避免直接将二甲基亚砜（DMSO）加入细胞悬液中，因为DMSO溶解时会释放大量热量，可能会损伤细胞。
• 选择合适的细胞状态：应选择处于对数生长期且细胞汇合度在80%-90%左右的细胞进行冻存操作，以确保细胞在最佳状态下进行冻存。
• 程序降温：使用程序降温盒以每分钟1℃的速度降温至-80℃，然后转移到液氮中长期保存。如果没有程序降温盒，可以按以下顺序降温：室温→4℃（20分钟）→-20℃（30分钟）→-80℃（过夜），注意在转移过程中保持冷却。
• 细胞密度：冻存时的细胞密度应适当，推荐密度为3×106到1×107细胞/mL。细胞密度过低可能会影响存活率。
• 避免长时间暴露于常温：细胞悬液加入冻存液后应尽量减少在常温下的放置时间，DMSO在常温下对细胞有较大的损伤。
• 使用高质量的冻存管：确保使用无菌、耐低温的冻存管，并在分装时做好标记，以便后续识别。
• 血清和DMSO的比例：常用的比例为90%血清+10%DMSO或55%基础培养基+40%血清+5%DMSO，根据具体细胞类型和实验需求进行调整。
• 细胞离心和重悬：细胞离心后应尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液。重悬时要轻柔，避免对细胞造成机械损伤。

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