二代测序的读长比较短，而
mRNA
长度较长，短
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需要经过计算来重建全长
mRNA
，进而定量基因表达或发现新的可变剪接。本文将评估
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种依赖参考基因组的方法（
Augustus, Cufflinks, Exonerate, GSTRUCT, iReckon, mGene, mTim,NextGeneid, SLIDE, Transomics, Trembly
，
Tromer
）和两种不依赖参考基因组的从头重建方法（
Oases
，
Velvet
）。由于模式或参数的不同，这
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种方法具体分为
25
种不同的
protocols
。
外显子核酸序列的鉴定
（敏感性：有多少比例的已知外显子核酸序列被重建，精确度：有多少比例的重建
RNA
核酸序列属于已知外显子。）
Augustus, mGene
和
Transomics
在线虫中有很高的敏感性，但精确度一般；在人和果蝇中，它们的表现则有明显的下降。
SLIDE
在三个物种中都有优异的表现。
Tromer
和
iReckon
虽有很高的敏感性，但精确度不高。对人而言，
Augustus, Exonerate, GSTRUCT, NextGeneid, Trembly
和
Velvet
的敏感性与精确度都高于
0.6
。
外显子个数的鉴定
大多数
protocols
在人中的精确度要低于其他两个物种，
iReckon
和
SLIDE
在线虫和果蝇中整体表现突出。
测序深度和内含子长度的影响
Augustus, mGene
和
Transomics
可以在极低丰度或测序深度时较好的鉴定出外显子，而其他
protocols
则有最低测序深度的限制。大多数
protocols
的敏感性与测序深度有简单的线性关系，直到平台期；
Tromer
是个例外；
Oases
与
Velvet
在较高测序深度时，效果也会下降。
Augustus, mGene
和
Transomics
有最高的内含子发现率。内含子的发现率会随着其长度的增加而降低，
Tromer
又是个例外。
鉴定出的内含子与已知内含子的比较
大多数
protocols
能较好的鉴定出已知内含子；
mGene, Transomics, Tromer, Velvet
和
Augustus
会鉴定出大量的新
junctions
。
Isoforms
拼接能力的比较
外显子缺失是所有
protocols
共有的缺陷，在线虫中平均
30%
，而在人中可高达
60%
。
Trembly
在人中拼接出了数量最多的完整的
isoforms
。
Augustus, mGene
和
Transomics
则鉴定出了最多数量的
isoforms
。
Assessment of transcript reconstruction methods for RNA-seq. Nature methods. 2013;10(12)
