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BioMed科技 · 公众号 · · 2025-01-28 19:45

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ARAF蛋白凝聚体：RAS相关癌症药物抗性的潜在机制

RAS/RAF/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在细胞增殖、分化和存活等过程中起着关键作用。RAS蛋白作为二元开关，在GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态之间循环，其激活由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）刺激，而信号终止则由GTP酶激活蛋白（GAPs）介导。RAF蛋白激酶家族成员（ARAF、BRAF、CRAF）作为RAS的主要效应因子，通过磷酸化MEK来激活MAPK信号传导。然而，ARAF在调节RAS激活中的分子机制尚不清楚。本研究旨在揭示ARAF在RAS激活中的作用及其在RAS相关癌症药物抗性中的潜在机制。

浙江大学苏文静、谢伟研究团队揭示了ARAF蛋白激酶通过其无序的N端序列形成与质膜相关的ARAF-RAS凝聚体，这些凝聚体集中活性RAS并阻碍NF1的负向调节，从而促进RTK触发的RAS激活。研究还发现，在RAS突变肿瘤中，ARAF N端的缺失或敲除可增强肿瘤细胞对泛RAF抑制剂的敏感性，而在激素敏感性癌症中，ARAF凝聚体的增加会导致内分泌治疗抗性，其耗竭则能逆转这种抗性。

相关内容以“Plasma membrane-associated ARAF condensates fuel RAS-related cancer drug resistance”为题于2025年1月27日发表在《 Nature Chemical Biology 》。

【主要内容】

图1 ARAF在质膜上形成固体状颗粒

通过在SKBR3细胞中转染ARAF-GFP质粒，研究者观察到ARAF在质膜上形成明显的颗粒结构，而BRAF和CRAF则没有这种行为。免疫荧光染色和电子显微镜分析进一步确认了ARAF在质膜上的分布和与RAS的共定位。此外，通过荧光恢复后光漂白（FRAP）实验和半变性琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）分析，研究者发现ARAF颗粒具有固态样特性，并且其形成依赖于ARAF的N端序列。

图2 ARAF的N端无序序列驱动质膜聚集

研究者通过构建ARAF的多种突变体，发现N端序列的缺失或突变会破坏ARAF在质膜上的颗粒形成能力。此外，通过表面等离子体共振（SPR）分析，研究者确认ARAF的N端序列并不直接参与ARAF与RAS的结合，而是通过其无序的特性介导蛋白凝聚体的形成。这些结果表明，ARAF的N端序列对于其在质膜上的聚集和功能至关重要。

图3 ARAF的N端介导ARAF-RAS颗粒的形成

通过体外凝聚体实验，研究者发现ARAF的N端序列能够介导ARAF与RAS的共聚集，形成微米级的颗粒结构。这些颗粒结构具有固态样特性，并且能够招募RAS而排除NF1 GRD。此外，通过荧光恢复后光漂白（FRAP）实验，研究者进一步确认了ARAF颗粒的固态样特性。这些结果表明，ARAF的N端序列在ARAF-RAS颗粒的形成和功能中起着关键作用。

图4 质膜组装的ARAF驱动RAS激活

研究者通过共定位实验和RAS-GTP水平的检测，发现ARAF在质膜上的组装能够促进RAS的活性，并且这种激活作用依赖于ARAF的N端序列。此外，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建的ARAF N端缺失的细胞模型，研究者发现ARAF N端的缺失或敲除可以增强肿瘤细胞对RAF二聚体抑制剂的敏感性。这些结果表明，ARAF质膜组装在RAS激活和药物抗性中起着重要作用。

图5 ARAF N端缺失增强RAF二聚体抑制剂的效果

通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，研究者构建了ARAF N端缺失的A549细胞模型，并发现这些细胞对RAF二聚体抑制剂的敏感性显著增强。此外，通过西方印迹分析和细胞生长实验，研究者确认了ARAF N端缺失对RAS-MAPK信号通路的抑制作用。这些结果表明，ARAF N端的缺失可以增强肿瘤细胞对RAF抑制剂的敏感性，从而提供了一种潜在的治疗策略。

图6 ARAF凝聚体驱动RTK相关的癌症药物抗性

研究者通过在激素依赖性乳腺癌和前列腺癌细胞中进行实验，发现ARAF的过表达与RTK激活相关，并且与内分泌治疗和抗雄激素治疗的抗性有关。通过细胞生长实验和动物模型实验，研究者证实了ARAF凝聚体在RTK相关癌症药物抗性中的作用。此外，通过分析癌症基因组图谱（TCGA）和METABRIC数据库中的患者数据，研究者发现ARAF的高表达与较差的生存率相关，进一步支持了ARAF在癌症药物抗性中的重要作用。

【全文总结】

研究揭示了ARAF蛋白激酶通过其无序的N端序列形成与质膜相关的ARAF-RAS凝聚体，这些凝聚体集中活性RAS并阻碍NF1的负向调节，从而促进RTK触发的RAS激活。在RAS突变肿瘤中，ARAF N端的缺失或敲除可增强肿瘤细胞对泛RAF抑制剂的敏感性，而在激素敏感性癌症中，ARAF凝聚体的增加会导致内分泌治疗抗性，其耗竭则能逆转这种抗性。研究结果表明，ARAF-RAS蛋白凝聚体是维持RAS活性和促进致癌RAS信号传导的独特亚细胞结构，靶向ARAF-RAS凝聚体可能是克服野生型和突变ARAF介导场景中药物抗性的策略。

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