一、导读：
在大部分投资者对“二代测序”（NGS）还没有搞清技术细节的情况下，“三代测序”（3GS）又火了。
本文结合各方面资料归纳总结了三代基因测序的发展历史、原理、优劣势，以及国内外布局的公司等（也就是说，这是篇三代测序“科普文”）。此外，我们对该英文文献部分原文进行了意译，以期能够对最新的算法和行业技术有粗浅的了解，有不符合原文意思之处，望多多海涵。（点击文末“阅读原文，有福利啦！）
背景：
中科院昆明动物研究所研究员马占山与美国马里兰大学叶承曦博士在基因测序领域的合作再次取得重要突破。合作团队几个月前正式发布了一款代号为 Sparc 的软件，针对第三代基因测序仪硬件错误率高达15%-40%的问题，研发出“基于稀疏分解的线性复杂度算法”，Sparc软件基于该新算法完成。使用测序深度为30x的Pac Bio 数据， Sparc能够达到错误率低于0.5%；使用更具有挑战性的Oxford Nanopore数据，Sparc能够达到和NGS相似的错误率。与现行方法相比，Sparc对于一致序列的计算更加准确，并且节省80%的内存和时间。这一重要突破为推进基因测序技术迈向三代技术的产业升级提供了又一关键软件技术。
总体观点：
我们认为，以Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为代表的三代测序技术在经过了多年发展后已经逐步趋于成熟。尽管当下该技术还有成本偏高、错误率较高、生物信息学分析软件不够丰富的问题，但其在读长、测序速度等方面都具有明显优势，三代测序设备已实现稳定性、小型化，未来随着准确度提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术是未来发展的重要技术趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。
具体到Sparc这一算法，根据文献我们认为其具有帮助提高测序精度、降低测序成本的可能性（特别是混合使用NGS和3GS数据时，或能够明显降低成本），值得给予关注。但是否能够实现商业化引用还有待观察（其发表的PeerJ期刊以影响因子及投稿命中率衡量并不是一线期刊）。而对于精准医疗板块，我们认为，虽然精准医疗在高估值和部分行业事件（如魏则西事件）的影响下表现平平，但也不乏催化剂，2016年3月8日，国家发布《科技部关于发布国家重点研发计划精准医学研究等重点专项2016年度项目申报指南的通知》。考虑到年初以来相关标的已有较大跌幅，如果后续市场风险偏好提升且有持续催化剂（如新的行业规划出台或者相关企业获得国家科技部精准医学研究重点专项支持），也是值得关注的领域，同时建议关注部分前期未完全发酵的新技术主题（如液体活检），关注新开源、丽珠集团、润达医疗、迪安诊断、美康生物。
风险提示：相关标的绝对估值较高，政策催化及技术革新具有不确定性。
二、三代测序行业背景：
1、基因测序技术发展的历史
1986年，第一台商用基因测序设备出现，间隔19年，第二代测序设备出现，从第二代设备到第三代设备只用了5年，说明基因测序设备更新换代速度加快。第一代测序技术，主要基于 Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序技术。第二代测序技术，早期代表平台包括 Illumina 的 Solexa、LifeTechnologies的Solid、罗氏的454平台等，目前二代测序设备在通量、准确度上都有了较大的提高，同时测序成本也随之大幅度下降，成为商用测序的主流。第三代测序技术又称为单分子 DNA 测序，即通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的，三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，未来随着技术的改善，三代测序设备将更为稳定和成熟。
测序技术的发展历程
2、第三代基因测序方法原理
Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。
PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体，芯片上有很多小孔，每个孔中均有DNA聚合酶。测序基本原理是： DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约数个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%，但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错（代价是重复测序，也就是成本会增加）。
相关技术确实专业性较强，若文字版难以理解，请移步视频版本：http：//www.le.com/ptv/vplay/24994915.html？ch=baidu_s
Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，设计了一种特殊的纳米孔（只能容纳单分子通过），孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。
如果阅读文字版无法理解的，同样请移步视频版（英文）：http：//v.youku.com/v_show/id_XNjYzMDUxNzY4.html
3、第三代基因测序技术的优势和劣势
相比于二代测序，三代测序具有如下优势：
1）第三代基因测序读长较长，如 Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均读长达到 10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。
2）直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了 PCR 扩增带来的出错。
3）拓展了测序技术的应用领域，二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
4）三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测；在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。
同时，第三代基因测序也存在一定的缺陷：
1）总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因；第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率（低于1%）。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。
2）三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。
3）成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。
4）生信分析软件也不够丰富。
4、国内外布局三代测序的公司
国外布局三代测序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015 年 10 月 27 日，国内公司瀚海基因（Direct Genomics）公布了基于 Helicos 技术研发的专门用于临床的第三代单分子测序仪 GenoCare 原理样机。中科院北京基因组研究所与浪潮基因组科学也在共同研制国产第三代基因测序仪。在测序仪价格方面，PACBIO 2011年的第一台三代测序仪PacBio RS在美国价格80万美金，2015年生产的sequel测序仪价格35万美金，大幅下降。在测序成本方面，预计未来5年内三代测序能达到100美元全基因组测序的价格。
目前，三代测序设备已实现稳定性、小型化，价格也在不断下降，分析软件不断丰富，我们认为随着准确度提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术是未来发展趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。
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