【高分综述 060】细菌衍生物介导的药物递送在癌症治疗中的应用：一种新一代策略

• 癌症是全球健康的重大挑战，导致每年数百万人死亡。癌症治疗的复杂性和异质性，以及对正常细胞的高毒性，使得癌症治疗变得复杂。

• 细菌衍生物介导的药物递送为克服传统癌症化疗的限制提供了新的研究兴趣。

• 本综述探讨了多种肿瘤靶向细菌及其衍生物在抗癌药物递送中的应用，并讨论了在调控条件下使用这些肿瘤靶向细菌及其膜泡进行抗癌治疗药物递送的优势和局限性。

细菌介导的抗癌药物递送

• 自19世纪末以来，研究人员一直在探索使用细菌和孢子作为抗击肿瘤的代理人。

• 受到细菌能够渗透肿瘤细胞并阻碍其生长的观察启发。这种开创性的方法涉及将各种治疗剂，包括强大的蛋白质和低分子量药物，直接注入肿瘤中。一些厌氧细菌种类已经证明能够克服通常阻碍传统化疗药物有效性的生理障碍。它们由于能够在肿瘤内部的缺氧条件下生存，因此非常适合精确的局部肿瘤靶向。

• 挑战依然存在，包括剂量依赖性细菌副作用和有限的治疗效力，因为网状内皮系统可以在细菌到达特定目标之前清除它们。

• 为了减轻这些挑战，大量研究集中在通过遗传和化学修饰微生物来降低系统毒性。例如，删除关键的毒力因子基因已被用来减弱各种细菌种类，包括沙门氏菌、梭菌、大肠杆菌和李斯特菌。

• 近年来，I/II期临床研究已经展示了各种细菌治疗的进展。这些治疗通常涉及使用含有细胞毒素蛋白、细胞因子、血管生成抑制剂、抗原和抗体的改良微生物作为抗癌剂。

• 改良细菌利用其复杂的感应系统实现自我引导运动，响应氧气、pH、温度和各种吸引性化学化合物的梯度。由于它们的生物功能和生物相容性，改良细菌可以在体内环境中施用抗癌治疗，利用它们独特的能力。

图1.

A. 遗传工程。通过细菌周期，质粒转染的细菌可以持续产生药物并实现药物的脉冲释放。

B. 连接子的嫁接。通过沙门氏菌形成的生物素抗体修饰和链霉亲和素修饰的NP“药物-连接子-细菌”。

C. 基于pDA-VNP的光热治疗产生的杀伤肿瘤细胞的效果进一步增强了细菌介导的生物疗法。

细菌表面修饰策略和优势

• 细菌的独特特性，包括它们操纵DNA的能力、快速生长、良好的定植能力以及表现出的靶向行为，在生物医学界引起了极大的兴趣。但是，也有障碍阻碍了治疗实施，包括细菌不可避免的有害不良反应以及在疾病部位的定植不足。

• 利用细菌表面的众多化学基团，已经进行了表面修饰以修改细菌表面结构和组成，减少它们的毒性或添加独特的治疗成分，以修改细菌的生物学特性并赋予它们新的角色。这些方法的进步将展示细菌在医学中的潜在作用，特别是在肿瘤免疫疗法中。

• 一般来说，细菌表面修饰方法可分为三类：化学、物理和生物。细菌表面由多糖、蛋白质和脂质组成，构成了复杂的生物结构。作为细菌细胞壁的重要部分，肽聚糖主要由小肽链、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺组成。此外，外膜中的肽聚糖和四肽酸含有大量的羟基。这些分子为膜提供了负电荷，允许通过静电相互作用进行表面修饰。

• 目前，细菌表面修饰是使用物理技术完成的，包括机械挤出和静电吸附。生物表面修饰使用遗传工程、生物合成和许多其他方法来改变细菌的表面结构，赋予它们额外的能力和改善的生物相容性，物理和化学修饰方法人工改善了细菌的表面结构。

图2.

1.饰包括通过细菌表面众多化学位点形成共价键，以及其他技术，如金属离子螯合、原位沉积、生物素-链霉亲和素偶联和原位聚合。

2.触、物理挤出、自组装和层层堆叠技术是物理相互作用的主要例子。

3.面可见结果的两种主要生物相互作用是遗传工程和生物合成。

药物携带细菌的细胞外壳

• 与细菌细胞相比，用于药物管理的细胞外壳提供了几个优势，其中关键的好处是它们无法在重要器官中定植。

• 通过遗传修饰活的细菌细胞以定制它们的内外表面，我们可以利用细胞外壳的潜力。重要的是，细胞外壳通过保留其表面特征保持了它们的免疫调节特性。

• 细菌幽灵（BG）是一种常见的细胞外壳类型，本质上是革兰氏阴性细菌的空细胞外壳，通过噬菌体X174的裂解基因E改变。基因E编码一个91-氨基酸多肽。当模拟的基因E在受控条件下在革兰氏阳性细菌中表达时，这些细菌迅速死亡而不会溶解。

• 蛋白质E是一种膜蛋白，能够寡聚并形成跨膜隧道结构，引起细胞质和其相邻环境之间的渗透压差异。

• 这导致细胞质内容物的驱逐、微生物细胞溶解，最终将细胞转化为无生命的覆盖物，因此得名“细菌幽灵”。这些细胞外壳的显著稳定性，甚至可以冻干，是一个值得注意的属性。

图3.

A. 激光照射诱导的OMV释放和体外免疫激活效应。EcP@TAPP NPs-PMAN制备示意图。

B. 示意图展示了创建和治疗双侧肿瘤模型的时间表。

C. 为了改善免疫疗法和EcP@TAPP NPs-PMAN对癌症的破坏，对TDLNs进行重塑。在尾静脉注射EcL和EcL@TAPP NPs-PMAN后，拍摄了携带4T1肿瘤的小鼠的主要器官的荧光图像（T：肿瘤，H：心脏，Li：肝脏，S：脾脏，Lu：肺，K：肾脏）。

细菌膜泡的生成

• 细菌通过自然过程将其膜出芽，将物质释放到周围环境中。一旦分离和纯化，由脂质双层包围的细菌膜泡（BMV）结构与真核细胞外泡（EV）惊人地相似。BMV可以由产生它们的细菌自发释放，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，通常大小范围在20至400纳米之间。

• 这些泡的释放环境显著影响各种生物活性，包括致病性、水平基因转移、代谢物排出、噬菌体感染和细胞间通信。

图5. 图示展示了由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌制造的几种细菌膜泡（BMV）类型，以及它们在感染和癌症治疗中的应用。

革兰氏阴性细菌的外膜产生了外膜泡（OMV）。

双层膜泡（DMV）和内膜泡（IMVs）是通过物理或生物方法制造的。

此外，使用遗传改良的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌制造BMV。

由革兰氏阴性细菌

产生的细菌膜泡（BMV）

外膜泡（Outer Membrane Vesicles, OMV）：

• 外膜泡（OMV）是由革兰氏阴性细菌产生的细菌膜泡（BMV）的一种，其形成与细菌的外脂膜和脂多糖（LPS）的存在密切相关。

• OMV的形成过程涉及外膜蛋白的不稳定，这些蛋白原本连接外脂膜与肽聚糖，形成稳定的革兰氏阴性细菌包膜。

• 当连接蛋白的稳定性受到影响时，可能是由于连接蛋白的移动导致肽聚糖与外脂膜之间的连接中断，或直接的连接断裂，导致OMV的释放。

• OMV的生成受到局部环境因素的显著影响，它们可以携带多种货物，包括蛋白质和遗传物质。

• OMV中可能含有的蛋白质包括那些促进肽聚糖与外脂膜之间相互作用的蛋白质，这些复杂的形成过程导致OMV具有不同的大小和组成。

• OMV的蛋白质研究对于理解组织靶向和信号传导至关重要，蛋白质组学在这一领域发挥了重要作用。

内膜泡（Inner Membrane Vesicles, IMV）：

• 内膜泡（IMV）是革兰氏阴性细菌产生的另一种BMV，它们是通过物理或生物方法产生的。

• 由于革兰氏阴性细菌的内膜被外膜和肽聚糖层保护，它们在自然条件下不易自发产生膜泡。

• 为了解决这一挑战，研究者开发了一种从革兰氏阴性微生物中产生细菌原生质体衍生的纳米泡（PDNV），也称为IMV的技术。

• 原生质体是通过溶菌酶的作用去除肽聚糖层（细胞壁）和有毒的外膜，是一种没有这些组分的细菌状态。

• 利用连续挤出方法有效产生IMV，这些IMVs已应用于开发通用的无佐剂疫苗，显示出比使用外膜泡（OMV）的疫苗更优越的有效性和安全性。

双层膜泡（Double Membrane Vesicles, DMV）：

• 双层膜泡（DMV）是为了解决作为药物递送系统时OMV和IMV可能面临的稳定性和货物装载挑战而开发的。

• DMV包含完整的细菌膜，并且具有包含多种关键抗原的独特属性，这些抗原对于疫苗生产至关重要。

• 通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）、生物化学和蛋白质组学的应用，证实了DMV确实包含了完整的细菌膜，并且与相同细菌产生的OMV相比，在由铜绿假单胞菌引起的脓毒症小鼠模型中显著增加了动物的生存率。

• DMV的增强适应性免疫和独特的生物分布，很可能是由于DMV上存在更多的病原体相关分子模式（PAMP）。

细菌驱动的生物杂交药物递送系统

• 药物递送系统的主要目标是将药物精确地运输并释放到体内的预定位置，同时保护药物免受不利条件的影响，如免疫反应和低pH值的挑战。系统还应保护健康组织免受潜在药物副作用的影响。

• 细菌不仅作为高效的微游动器，还充当微传感器，能够感知环境的物理化学属性变化，如pH值、氧气水平、葡萄糖水平和温度，并对此做出反应。

• 细菌感知的有效性通常依赖于将细菌细胞放置在目标作用点附近，且这种感知在短距离内最为有效。因此，实现对体内药物递送设备位置的主动控制是理想的。

• 合成移动微机器人在小尺寸下运行时面临各种技术限制，但生物杂交方法，即微生物细胞与微/纳米颗粒的结合，旨在克服这些限制。

• 这种整合使生物杂交体能够协作并执行高级功能，这些功能是生物或合成组分单独无法完成的。

• 例如，当接近目标作用点时，细菌可以利用趋化感应和操纵；当远离目标时，可以采用远程磁操纵引导配置为模拟微机器人体的微生物向所需位置移动。

• 生物杂交方法的一个主要优点是生物和非生物系统之间的“分工”，这减少了对细菌细胞进行重大遗传改变的需求。

• 将细菌纳入生物杂交系统时，最好选择非致病性、最好是食品级或共生细菌，并且变异尽量少或没有。

• 这种选择符合细菌主动响应环境梯度的基本需求，虽然可能无法完全利用细菌的所有优势特征，但它简化了细菌药物递送系统的概念，使其更实用于实施。

• 后续部分将深入探讨改进生物杂交药物递送系统的基本设计标准，这里我们关注基于细菌的药物的不同给药途径，包括肿瘤内注射、口服给药、静脉注射和鼻内给药。

纳米粒子介导的抗癌药物递送

• 纳米粒子（NP）因其出色的药物载荷能力、制造简便和生物相容性而在肿瘤治疗中被广泛使用。

• 有机纳米粒子尤其受到青睐，因为它们具有生物相容性、可生物降解性和适应性等多种优势特性。

• 纳米技术的进步促进了多种治疗物质的整合到NPs中，包括脂质体、基于二氧化硅的多孔成分、聚合物结构和胶束。

• 纳米递送系统的首个重要里程碑是引入了含有多柔比星（DOX）的脂质体纳米递送系统，其直径约为100纳米。

• 这一创新增强了药物的药代动力学和分布，得益于纳米材料在肿瘤中的被动积累，这是通过EPR效应实现的。

• 载药NP显示出比无药NP更高的肿瘤摄取率和更低的系统毒性。尽管纳米粒子药物递送系统在癌症治疗中显示出巨大潜力，但它们也存在某些缺点。

• 纳米粒子可能面临深入穿透肿瘤组织的挑战，这可能影响药物的分布和效力。

• 纳米粒子可能被免疫系统识别并清除，减少了它们的循环时间，降低了向癌细胞递送药物的有效性。

• 一些纳米粒子可能表现出毒性或在健康组织中引起炎症反应，导致不良反应。

• 纳米粒子可能需要特定的存储条件，并且稳定性有限，这可能影响它们的保质期和临床使用的实用性。

• 尽管这些变量对纳米药物递送过程的有效性有重大影响，从而决定了治疗效果，但用于医疗治疗的NP通常具有特定的大小、形状和表面特性。

• 直径在10至100纳米范围内的纳米粒子通常被认为适合癌症治疗，因为它们能够有效地运输药物并提供增强的EPR效应。

• 大于100纳米的NP可能会通过吞噬细胞从循环中移除，而较小的NPs可能会从正常血管中逸出并迅速通过肾脏过滤。

• 与基于其他纳米粒子的药物递送系统相比，细菌介导的药物递送治疗癌症提供了某些优势。

• 细菌能够主动靶向并深入穿透肿瘤组织，这可以增强向癌细胞递送药物的有效性。

• 此外，细菌可以被设计为在肿瘤微环境中特别释放治疗剂，最小化非靶向效应并降低系统毒性。通过细菌介导的癌症抑制涉及多种途径，包括激活免疫系统。

• 总的来说，细菌在靶向和向癌细胞递送药物方面的独特能力，使它们成为癌症治疗中的一个有前景的方法。

图6. 一个基于脂质体的智能药物递送系统在癌症治疗中的步骤示例。

细菌基于药物的给药途径

肿瘤内注射（Intra-tumoral injection）:

• 肿瘤内注射是将药物直接注入或靠近肿瘤区域，对于药物递送到目标部位非常有效。

• 例如，与系统给药相比，沙门氏菌（S. typhimurium）的肿瘤内注射在减少肿瘤抑制和副作用方面显示出显著改善。

• 直接注射对于难以通过循环系统到达的解剖区域特别有用，如受血脑屏障（BBB）保护的中枢神经系统。

• 细菌通过直接注射进入脑肿瘤治疗显示出相当的潜力。此外，肿瘤内注射治疗微生物可以减少系统毒性，治疗后可以用抗生素消除，减少环境释放风险。

静脉注射（Intravenous injection）:

• 静脉注射是药物递送的有效方法，尤其适用于血液供应丰富的肿瘤。

• 尽管系统性注射细菌可能导致严重的系统性感染，但在小鼠中的实验表明，包括沙门氏菌（S. typhimurium）和双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）在内的多种菌株并未受到阻碍。

• 细菌能够穿透并在肿瘤的缺氧和坏死区域中生存，这些区域对传统治疗的效果较差。然而，将这种方法应用于大型动物的可行性仍在调查中。

口服给药（Oral administration）:

• 口服给药是一种广泛采用的药物递送方法，因其方便、适应性强、非侵入性和患者接受度高。

• 对于治疗特定的胃肠道（GI）道疾病，如炎症性肠病综合征特别有益。

• 口服药物递送系统必须能够穿越肠上皮屏障，并与复杂的GI环境有效互动，包括pH变化、消化酶和共生细菌群落等因素。

• 一种解决这些挑战的方法是使用胃肠道共生细菌，如乳酸菌（LAB），特别是乳球菌（Lactococcus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）。

• 口服给药的基因工程B. longum被用来治疗溃疡性结肠炎、开发丙型肝炎病毒疫苗，以及使用抗炎细胞因子IL-12管理心肌炎。

鼻内给药（Intranasal administration）:

• 鼻途径在早期的基于细菌的药物载体应用中被使用，特别是在粪便微生物群移植中。

• 由于粘膜表面的可及性，鼻内给药主要用于免疫接种。

细菌内药物装载

电穿孔:

• 电穿孔是一种提高细胞膜通透性的方法，通过向细胞传递短暂的高电压电脉冲实现。

• 该过程在细胞膜表面产生临时孔洞，使得原本难以通过的物质能够移动。

• 可逆电穿孔利用短暂的电脉冲促进细菌吸收药物或脂质体，同时保持细菌的生物活性。

• 电穿孔对细菌造成一定损伤，处理过的细菌与未处理的对照微生物相比，可能表现出不同程度的生物活性下降。

遗传工程:

• 遗传工程方法通过转染携带抗癌药物的质粒DNA片段来修改细菌的基因。

• 通过遗传改变，细菌能够持续产生与癌症预防相关的多种化合物，包括免疫因子、肿瘤抗原、细胞毒素剂等。

• 遗传改良的细菌通过表达与肝癌相关的特定AFP触发免疫反应，涉及T细胞，以根除和消除肿瘤。