胶质母细胞瘤（glioblastoma）是一种毁灭性的疾病，往往在晚期诊断出，进展快速，且生存率低。结构变异（SV）以及基因融合（包括那些涉及EGFR（表皮生长因子受体）的融合在内），通常是疾病发展的驱动因素，因此也成为受人关注的治疗靶点。
图1：聚合酶读长和插入片段大小分布
A. 单个SMRT cell典型的读长分布。
B. 在37个SMRT cell上测序的读长和插入片段大小指标，表明产量高度重复。
考虑到成本效益，基因组图谱的绘制——例如癌症基因组图谱计划（Cancer Genome
Atlas）所开展的工作，在很大程度上依赖于短读长测序技术。人们担心，高达19%的遗传疾病基因不能通过短读长测序的方法进行充分测序，并且短读长测序经常检测不到插入/缺失（INDEL）和大的结构变异。假阴性结果的风险则源于短读长测序引入了PCR偏倚、不能均匀覆盖富含GC序列，以及短读长的测序和比对在基因组的重复区域所存在的困难。
长读长测序技术，如PacBio®
Sequel™测序，绕过了这些难题，让科学家能获得无偏倚、更完整的基因组视图。此外，通过PacBio
Sequel平台发表的信息表明，在鉴定结构变异上，低覆盖度的PacBio测序比高覆盖度的Illumina测序更有效得多。同时，PacBio
Sequel单分子实时（SMRT）技术不断发展，与过去的RSII技术相比通量更高，起始量要求更低，周转时间更短，并且成本更低，让这些类型的项目更容易实现。
根据上述信息，并按照我们客户项目的目标——改善胶质母细胞瘤的基因组DNA样品的结构变异检测，金唯智在PacBio
Sequel平台上对人类样品进行了全基因组测序分析，成功鉴定出近20,000个之前无法确定的结构变异。
PacBio Sequel测序生成了几十万条长序列
我们总共利用37个Sequel SMRT cell对精心制备的SMRTbell™
文库进行测序（详见方法部分），每个SMRT cell平均生成5.7
Gb的数据和496,040条聚合酶序列。读长分布是PacBio测序特有的，平均聚合酶读长为11.5 kb，而N50为17.8
kb（图1）。对于不同的文库和SMRT cell，产量高度一致，且最长的聚合酶序列超过52 kb。
高度准确的一致序列的生成
PacBio错误图谱是很有特色的，序列特异性偏倚很少或没有，这带来了高度准确的测序结果，其准确性超过99.999%（QV50）（图2）。这个项目的目标是鉴定大的结构变异，而不是单核苷酸变异。因此，考虑到成本效益，客户选择了低覆盖度的选项。
图2：PacBio的准确性
A. PacBio
Sequel测序的原始准确性是通过将序列与参考基因组比对而评估的。平均single-pass准确性达到81.95%，其范围在~70-90%。
B. 由于PacBio没有序列特异的错误偏倚，故只需要提高覆盖度就能实现高度准确的组装（图片由PacBio提供）。
大约20,000个结构变异的鉴定
使用SMRT Link
3.1.1中的pbalign和Arrow将每个样品的序列与人类参考进行比对。整个基因组的覆盖度相对平均分布，而平均覆盖度为9.0倍。
最近一项直接比较短读长和长读长技术的研究表明，PacBio测序在检测大小在7 bp至1
kb的变异上灵敏度高了5倍3。因此，所有≥ 7 bp的变异都被过滤和注释。以001号个体为例，检测到超过461
kb的序列差异，由19,224个变异所编码。在基因组的基因和基因间区域都检测到各种类型的变异，包括已知基因的编码区和非编码区（图3A）。除了在所有个体中检测到kb大小的插入和缺失，一段大的纯合缺失也被检测到，涉及到所分析的部分基因组中的一条染色体（图3B）。
图3：001号个体中结构变异的鉴定
A. 变异经过注释，并根据大小≥ 7
bp的INDEL数量作图。
B. 在一条染色体上检测到大的纯合缺失。
结论
这些研究强调了长读长在鉴定结构变异上的价值，否则短读长技术可能错过。如上文所述，结构变异往往是疾病进展的驱动因素，因此清楚了解其在患者样品中的存在将有助于更好地了解复杂疾病。本文提供的信息可供客户进一步分析。
获得一份高质量且完整的基因组视图，不仅仅对这里提及的肿瘤学研究很重要，也对众多领域有意义，包括作物开发、进化/比较生物学，以及传染病的鉴定。PacBio
Sequel仪器的产量是PacBio
RSII仪器的7倍，且项目周转时间更快，将PacBio测序的优势扩展到大型和小型的复杂基因组研究，而这在过去的RSII技术来说往往成本太高。
未来应用
PacBio技术不断的改进，如增加读长、每个SMRT
cell生成更多数据以及提高原始序列准确性，将为PacBio的其他广泛应用带来许多好处，包括：
▪ 小型和大型基因组的测序和de
novo组装
▪ 连续的长扩增子测序
▪ mRNA异构体测序（Iso-Seq）
▪ 靶向捕获测序
▪ DNA修饰分析，不需要亚硫酸氢盐处理
PacBio测序正在催生令人兴奋的研究，它带来新颖的研究成果，正影响到各个行业和领域。利用新的Sequel平台实现的高通量且经济的测序，将这些可能性扩展到比以往更多的科学家。
PacBio将推出新的应用程序，协助稀有变异等分析
