专栏名称: 北京生物结构前沿研究中心

北京生物结构前沿研究中心由清华大学与北京市科学技术委员会联合共建，成立于2018年，中心主任为施一公教授，执行主任为王宏伟教授。作为北京市构建高质量发展新范式的新型研发机构，中心致力于开展关键核心技术攻关和从0到1基础科学难题突破。

Nature | 高分辨率冷冻电镜结构揭示RNA中复杂的水分子网络

北京生物结构前沿研究中心 · 公众号 · · 2025-03-24 17:22

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水分子和离子对维持生物分子的稳定性和功能有效性至关重要。与大多数蛋白质或蛋白-RNA复合物不同，RNA形成的明确结构核心区域存在广泛的水合作用。水分子既独立作用又与离子协同参与RNA的稳定性维持、催化过程及动态调控。在RNA折叠与功能实现中，既有高度有序的水分子（orderwd）和离子网络，也包含弥散分布（diffuse）的水合环境。因此，RNA-only结构为理解水分子如何与生物大分子相互作用并维持其稳定性提供了独特的研究窗口。

然而，RNA固有的柔性（flexibility）对实验结构解析提出了挑战。分子动力学（MD）模拟能够揭示当前冷冻电镜（cryo-EM）和X射线晶体学方法难以捕捉的动力学与结构信息。例如，MD研究已预测出稳定水分子（long-lived）结合位点、Mg²⁺结合位点以及完全水合金属离子链的存在。然而，传统分子力场的参数化敏感性和经典理论假设的潜在误差，降低了这些推论的可信度。

近日，中国科学技术大学的 张凯铭教授 联合斯坦福大学的 Wah Chiu、Rhiju Das 课题组，通过2.2 Å和2.3 Å分辨率cryo-EM图谱，首次解析了处于水合状态且具有酶活性的四膜虫核酶（ Tetrahymena ribozyme ）在无底物状态下的结构，实现了对复杂RNA三级结构中有序水分子相互作用的精细解析及置信度评估。相关研究 “Complex water networks visualized by cryogenic electron microscopy of RNA” 于2025年3月11号发表在 《Nature》 杂志上。

图1 四膜虫核酶的高分辨率分子模型

单颗粒cryo-EM经过图像分类后，得到了两张分辨率分别为2.2Å和2.3Å的四膜虫核酶密度图，其Rosenthal-Henderson B-factor值分别为63和66Å ² 。通过叠合两个原子模型发现，结构差异主要集中在P9.2和P6这两个外围结构域——这两个结构域均向外延伸至溶液中，与核酶其他部分没有相互作用。

图2 利用SWIM检测水分子和Mg ²⁺

由于分辨率的限制，仅在紧邻RNA原子的溶剂层中分辨率足够高，因此研究人员严格将峰值的归属（peak assignment）限制在这一层内。利用SWIM （Segment-guided Water and Ion Modeling）算法，分别在2.2Å和2.3Å分辨率的核酶密度图中建模了255和281个水分子，以及47个Mg ²⁺ 。

为了探究这些水分子位置和归属的可信度，研究人员检查了在这两张密度图中建模的水分子是否具有相同的位置。这些共有的水分子在下文中被称为“consensus waters”。在SWIM建模的水分子中，有134个被识别为consensus waters，分别占2.2Å和2.3Å模型中所有SWIM水分子的53%和48%。

尽管所有建模的水分子都具有较高的分辨率（Q-score > 0.7），但consensus waters的Q-score在统计学上显著高于non-consensus waters，并且这些水分子所在的RNA区域在统计学上也具有更高的分辨率和相似性。

在cryo-EM结构中，consensus waters结合在核苷酸的所有区域。然而，某些区域的水合密度较高或较低。有趣的是，核酶的催化活性位点中每个核苷酸周围的水分子数量与其他区域相似，这表明有序的水分子可能普遍对三级相互作用很重要。

图3 水分子和Mg ²⁺ 与核苷酸的结合

在保守的催化核心的其他区域，结构域P6a的骨架与P3-P4接合点（junction）非常接近，该相互作用由一条水分子链介导。例如，一个先前未被建模的水分子桥接了C216的糖基和U106的磷酸基团。一个新识别的水分子结合了P6a小沟中的G215-U258摆动碱基对，并与U258的O2和O2’以及G215的N2形成氢键。此前在一个不相关的RNA系统的A-form螺旋中也发现了一个具有相同结合原子的水分子，该水分子还与下游胞苷（cytidine）的O2形成了额外的接触。此处结构中也包含一个下游胞苷C216，其O2与建模的水分子之间的键长为3.3 Å，但C216-O2与水分子和G215-N6之间的角度为79°，这对于水分子的四面体排列（109.5°）来说太小了。因此，更可能的是，水分子与P3和P4接合点中的A105的O2’形成了氢键。因此，这个水分子可能在稳定P6a、P3和P4之间的三级相互作用中发挥作用。这个例子说明了为了稳定三级相互作用，水分子网络的结构可能与经典的A-form螺旋中的预期结构不同。

图4 弥散的cryo-EM密度图与MD水分子网络

此外，研究人员在2.2 Å和2.3 Å密度图以及MD预测的水分子网络中均观察到了弥散密度线。通过分析密度切片，他们发现水分子网络沿着螺旋沟槽和骨架分布，尤其是在三级接触区域（tertiary contacts）附近。进一步聚焦P6a骨架周围，研究人员发现了一个复杂的水分子网络。SWIM算法在2.2 Å和2.3 Å密度图中分配的水分子位置匹配良好：共有八个水分子被建模在相似的位置，其中六个位置与MD模拟水密度的局部最大值重叠，表明MD能够预测部分局部有序的水分子。尽管SWIM在两个独立密度图中的五个水分子位置上存在差异，但这些位置的溶剂壳层冷冻电镜密度图高度相似。此外，cryo-EM和MD在低等高线处也表现出一致性，说明两者不仅在许多有序水分子结合位点上吻合，还在水分子网络的弥散性上保持一致。即使在密度图弥散性较高、SWIM无法精确定位水分子的区域，这种一致性依然存在。

本研究通过冷冻电镜（cryo-EM）在2.2和2.3 Å分辨率下研究了高度水合的四膜虫核酶。利用SWIM算法，结合分辨率和化学参数，自动建模并交叉验证了核酶核心中的水分子和Mg ²⁺ ，揭示了水分子在介导RNA非经典相互作用中的广泛作用。在SWIM未建模有序水分子的区域，cryo-EM与MD预测的复杂水网络高度一致，解释了其难以通过传统原子坐标建模捕捉的原因。总之，本研究展示了通过cryo-EM、统计和化学指标以及MD模拟揭示生物分子周围刚性和柔性水分子分布的方法。