DNA作为生物体的主要遗传物质，编码了生物功能和发育的基本指令。因此，高效且准确的DNA复制是地球上生命得以稳定延续的重要基础之一。然而，完成精确无误的DNA复制往往充满了挑战，其中一个重要的挑战就是DNA复制叉在正常前进时会遇到在模版DNA中所存在的各种障碍【1,2】。DNA单链断裂（SSB）是最常见的内源DNA复制叉障碍之一，以其在每个细胞中高达每天10000次的频率，成为基因组维持稳定性和完整性的巨大挑战【3】。Aguilera团队、Ira团队、Walter团队和Nussenzweig团队先前的研究表明，DNA复制机器和位于模版DNA前导链或滞后链上的单链断裂相遇会产生单端（seDSB）和双端（deDSB）DNA双链断裂【4-7】。无法修复此类DNA双链断裂可能会导致基因突变以及复杂的基因组重排活动，进而增加基因组不稳定性，可能会推动癌症和其他遗传疾病的发展。因此，进一步系统性学习细胞如何修复此类由DNA复制产生的双链断裂对于了解细胞如何在基因组复制过程中维持基因组完整性具有重要意义。2024年11月18日，英国牛津大学教授Matthew Whitby团队在Molecular Cell杂志上发了表题为DNA nicks in both leading and lagging strand templates can trigger break-induced replication的文章。该研究发现，在裂殖酵母（S.pombe）中，当DNA复制机器与在模版DNA前导链或滞后链上的DNA单链断裂相遇后，均会转化为双端DNA双链断裂（deDSB）。此类双链断裂主要是通过无错误的同源重组（HR）机制来进行修复。同时，本次研究首次揭示了在模版DNA前导链和滞后链上的单链断裂也可以诱发高度诱变的断裂诱导复制（BIR）机制，进而极大增加了基因组的不稳定性。在本研究中，研究者利用了不同类型的切口酶，特别是CRISPR-Cas9变体Cas9n D10A和Cas9n H840A, 在裂殖酵母中建立了可在模版DNA前导链或滞后链上的特异位点进行切割的DNA单链断裂切割系统。应用此系统，团队首先发现表达两种Cas9n变体的细胞和表达野生型Cas9的细胞均可产生相似水平的双端DNA双链断裂。重要的是，由Cas9n变体所产生的双端双链断裂主要出现于细胞分裂周期中的DNA复制周期（S周期）。这进一步证实了DNA单链断裂可在DNA复制过程中转化为DNA双链断裂。同时，通过ade6直接重复报告基因，团队监测到Cas9n诱导的DNA断裂会导致高水平的同源重组（HR）修复，与其他团队如Jasin团队通过DR-GFP报告基因在哺乳动物细胞中观测到的结果类似【8】。进而，研究人员还发现，由Cas9n切割的单链断裂与复制机制相遇引起的DNA双链断裂主要通过由Rad51介导的姐妹染色单体重组（Sister Chromatid recombination）来进行修复。尽管同时观察到了Cas9n诱导的复制相关双链断裂也可以由单链退火（SSA, Single-Strand Annealing）途径来进行一定程度的修复，但是SSA途径受到了Rad51存在的抑制。与之相比，由野生型Cas9产生的双链断裂主要通过单链退火、非同源末端连接（NHEJ）或替代非同源末端连接（Alt-NHEJ）通路进行修复。这些发现表明，由复制叉子与单链断裂（SSB）相遇而产生的DNA双链断裂保留了一个完整的姐妹染色单体，进而可以作为模版来通过同源重组（HR）通路进行准确无误的双链断裂修复。与Cas9n 不同的是，野生型Cas9倾向于直接在两个姐妹染色单体中同时产生双链断裂，从而阻断了更精确的HR修复通路。本研究的重大突破是发现由单链断裂与复制机制相遇所诱发的双链断裂均可诱发断裂诱导复制（BIR）通路。先前对BIR通路的研究大多仅在芽殖酵母（S. cerevisiae）中进行，且仅运用了与复制无关的DNA双链断裂系统。团队发现Cas9n诱导的复制相关双链断裂会导致高水平的模版转换（Template Switching）活动，此活动为BIR相关诱变的标志性特征。与此同时，由Cas9n和其他切割系统诱导的断裂修复也被证实依赖于Rad51、Pfh1和Cdc27等众所周知的BIR驱动因子。更重要的是，本研究证实了延迟来自相反方向的聚合复制叉的抵达可以增加更多BIR相关突变。这一现象昭示着当复制叉与模版DNA前导链或滞后链的单链断裂相遇时，会先产生单端双链断裂（seDSB），从而首先诱使高诱变性的BIR通路启动。然而，及时的复制叉汇合（Fork Convergence）似乎成为确保单端双链断裂（seDSB）转化为双端双链断裂（deDSB）的关键因素，从而可以使用如同源重组（HR）等更可靠的修复途径，为维持基因组的稳定性提供更安全的保障。同时，BIR等高诱变性的通路是作为万不得已时才会被启用的通路。最后，团队也发现，一种典型的参与非同源末端连接（NHEJ）通路的蛋白Ku70似乎可以阻断由复制相关的双链断裂而诱导的BIR通路。研究小组认为，Ku70可能会与单端双链断裂（seDSB）的末端所结合，从而延迟参与BIR通路的相关蛋白的募集。这个有趣的现象等待进一步的探索和研究。综上所述，作为本领域领先的研究小组之一，Whitby团队发现当位于模版DNA前导链和滞后链的单链断裂（SSB）与DNA复制叉相遇后，都可以形成双端DNA双链断裂（deDSB），进而通过精准无误的同源重组（HR）通路来修复。更有趣的是，团队首次发现位于两条链上的单链断裂均有可能诱发更易致突变的断裂诱导复制（BIR）事件。本研究系统地展示了常见的未及时修复的DNA损伤，如DNA单链断裂，可如何破坏细胞中正在进行的DNA复制。如果细胞无法及时解决此类损伤，就会导致复杂的基因组突变，而此类突变通常与癌症及许多人类疾病相关。英国牛津大学生物化学系Matthew Whitby教授为本文的通讯作者。Whitby教授团队的徐瑗琳博士（现为纪念斯隆凯特琳癌症中心博士后研究员）和Carl Morrow博士为论文的共同第一作者。Whitby教授团队的贾粟等其他成员也对本工作有重要贡献。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.10.026
制版人：十一
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