本文研究了三阴性乳腺癌（TNBC）中组蛋白脱乙酰酶“H基因”的液液相分离（LLPS）现象。文章通过提出假设并验证，探讨了“H基因”的LLPS现象与磷酸化之间的关系，以及这一关系对肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力的影响。同时，文章还分析了“H基因”的LLPS对染色质组蛋白乙酰化、染色质互作和转录重编程的影响。
通过抑制“H基因”的磷酸化，文章观察了“H基因”的LLPS现象的变化，证实了磷酸化对LLPS的影响。
文章发现“H基因”蛋白序列上的两个IDR序列，其中IDR1对LLPS起到重要作用。同时，还发现了IDR1中的一个磷酸化位点对于LLPS的重要性。
文章分析了“H基因”的LLPS被抑制后，染色质结构、染色质可及性和转录活性的变化，并发现与原癌基因ATF3的表达有关联。
在验证ATF3与“H基因”的LLPS关联性时，文章稍显草率，可能需要更深入的验证。
一篇文章要怎么看才能理清思路呢？其实就要看这篇文章的假设是如何提出，得到了什么样的结果，又通过假设的迭代如何推进整个课题的进展（一篇文章或者一个课题，假设以及假设的迭代都非常重要，在假设的迭代过程中，会不知不觉地推动课题得到最后的结论，这都是对于文献阅读过程中比较重要的信息，不清楚假设以及假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。今天讲的这篇文章就挺有意思，这篇文章是南方医科大学广东省人民医院和中山大学两位博士研究生，发表在23.5分的Nature大子刊Nat Cancer上的文章，他们做的是相分离：
LLPS（液液相分离）大家应该都熟悉了，这个在之前都介绍过。由于蛋白质的IDR（内在无序结构域），会导致蛋白质的聚集，与外界形成LLPS的状态：
这篇文章研究的就是TNBC（三阴性乳腺癌）中的LLPS现象，他们研究的重点是“H基因”，“H基因”是一种组蛋白脱乙酰酶，所以它对于染色质的组蛋白乙酰化具有表观修饰的作用。也就是说“H基因”的LLPS很可能会通过影响TNBC中的表观修饰，造成转录组的变化。他们首先发现在TNBC中“H基因”的LLPS比正常组以及普通的乳腺癌要高跟多，同时”H基因”的磷酸化，在TNBC中也有明显的增强。于是他们就提出了第一个假设，假设“H基因”的磷酸化可能对于其LLPS有一定的贡献（假设的提出，就是基于一定的实验基础或者统计基础，比如生信分析，总结出一个可以证伪的命题，通过这样的命题提出，来进行进一步的验证，不清楚假设提出的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。为了验证这个假设，他们使用1,6-Hex抑制了“H基因”的磷酸化，结果发现，磷酸化抑制后，“H基因”的LLPS现象也减弱了：
这也就说明了“H基因”的磷酸化的确对于其LLPS有一定的影响，那么具体是什么导致了这一影响呢？他们分析了“H基因”的IDR，发现“H基因”蛋白序列上有两个IDR的序列。通过分别对两个IDR的敲除，他们发现IDR1对于“H基因”的LLPS，起到了重要作用，而“H基因”的IDR1区域中有着一个磷酸化位点，通过对该磷酸化位点的拟磷酸化以及拟去磷酸化突变，证实了“H基因”的这个磷酸化位点对于其LLPS的重要性（缺失两种IDR，以及突变IDR1中的磷酸化位点，其实都是柯霍氏法则的验证方法，通过这样的验证能明确结构域以及磷酸化位点对于LLPS的功能，而磷酸化位点的突变，避免了肯定后件的逻辑谬误，在这里我验证是十分出色的，不清楚柯霍氏法则以及肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《轻松的文献导读》、《列文虎克读文献》、《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。而“H基因”的IDR1中磷酸化位点的突变，同时也能影响肿瘤细胞的增殖以及迁移侵袭能力，这就更证明了其重要性。同时这个IDR所在的位置正好是NLS（核定位序列），而在NLS旁边的序列正巧是NES（出核序列），于是他们使用了NES缺失的“H基因”来进行分析，结果发现NES的缺失，可以提高“H基因”的LLPS效率。也就是说，“H基因”的入核是其LLPS的关键因素之一：
接着，他们就对“H基因”的抑制剂进行了筛选。通过筛选，他们发现NA（Nexturastat A）这种选择性“H基因”抑制剂，可以有效地抑制“H基因”的LLPS。而其他的“H基因”抑制剂并不能达到这种效果，同时NA也能有效抑制TNBC细胞的增殖：
NA就是一种研究“H基因”的LLPS的工具，通过NA来抑制“H基因”的LLPS，可以用来分析“H基因”的LLPS具体的成因以及下游的变化。他们首先通过质谱分析了与“H基因”结合的蛋白，在使用了NA后这种结合又需要被抑制，筛选出来的蛋白有可能就是导致“H基因”产生LLPS的原因（其实这就是假设的迭代，通过使用抑制剂抑制磷酸化的“H基因”的LLPS，来分析“H基因”的结合蛋白的变化，迭代出新的假设，也就是造成“H基因”的LLPS的原因，再加以验证，假设的迭代就是通过已知信息进行分析并推动课题的一种方法，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。经过筛选后，他们找到了14-3-3θ，它与“H基因”的结合能促进磷酸化后的“H基因”产生LLPS聚集。而另一种筛选出来与“H基因”结合的蛋白importin-β，则是促进“H基因”的核转运蛋白：
那么“H基因”产生了LLPS后，对于下游又会产生什么样的影响呢？大家都知道“H基因”是一种组蛋白去乙酰化酶，也就是说对于染色质会有根本的影响，染色质的组蛋白乙酰化变化，会引发染色质的互作发生变化。所以他们进一步分析了使用NA后，也就是抑制了“H基因”的LLPS后，染色质互作的影响。结果发现磷酸化“H基因”的LLPS被NA抑制后，染色质结构也发生了改变：
那么染色质结构的变化，是否会引起转录层面的影响呢？于是他们分析了NA使得磷酸化“H基因”的LLPS抑制后，TNBC细胞中的染色质可及性和转录活性的变化。结果发现磷酸化“H基因”的LLPS被抑制后，染色质转录产生了重编程，肿瘤抑制基因上调、原癌基因下调，癌细胞中表达的免疫调节剂激活：
在最后，他们选择了“H基因”的LLPS调控的较为明显的原癌基因ATF3，通过敲减ATF3与“H基因”的LLPS的关联性（实际上，这里的验证部分偏离的原命题，原命题应该是“H基因”的LLPS对于ATF3的H3去乙酰化，导致了ATF3表达增加，促进了肿瘤增殖”，但这里通过敲减ATF3验证的命题则变成了“H基因”的LLPS导致了ATF3表达增加，促进了肿瘤增殖”，其实这里验证的命题产生的差异，会产生较大逻辑漏洞，而同时通过敲除ATF3来进行验证，则更可能会引起肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题以及肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。总的来说这里的验证就稍显遗憾了，如果要验证这一点的话，可能需要使用CRISPR去特异性促进ATF3的H3组蛋白乙酰化，才能进行验证了：
最后他们就形成了这样的示意图，磷酸化的“H基因”通过importin-β引导入核，然后通过结合14-3-3θ促进了其LLPS，“H基因”的LLPS导致染色质组蛋白乙酰化变化，引发了染色质可及性以及转录的变化，促进了原癌基因如ATF3的表达，导致了肿瘤的进展：
总的来说，这篇文章的假设以及假设的迭代推进了整篇文章的逻辑以及进展，是一篇蛮有意思的文章。唯一的缺憾，就是在最后验证ATF3的时候有点草率了，但如果再深入验证的话，可能又会是另一个故事了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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