“肿瘤微环境异质性+治疗响应”依旧能打，换个癌种，轻松上9+SCI！

Biomarker Research 上发表的新文章通过单细胞转录组测序分析揭示了食管鳞状细胞癌（ESCC）中癌相关成纤维细胞（CAFs）的异质性，并发现新辅助免疫化疗（neoICT）通过改变CAFs亚群组成和增强CAF-T细胞相互作用，其中 NECTIN2-TIGIT 通路与治疗抵抗性相关，为ESCC治疗提供了新靶点。

方法

数据来源： 从唐都医院获取接受新辅助免疫化疗的食管鳞状细胞癌（ESCC）患者的41个手术样本并进行单细胞转录组测序；从TCGA获取转录组数据及其临床信息。

单细胞转录组分析： 使用CeleScope 处理测序数据，STAR比对人类基因组 GRCh38/hg38，R包Seurat 进行后续分析。

拟时序分析： 使用Monocle2 和Monocle3 重构CAFs的分化轨迹，分析细胞状态的变化。

RNA速率分析： 使用 python中的 Velocyto和 scVelo分析RNA速率，预测细胞状态转变方向。

细胞间通信分析： 使用 CellPhoneDB工具基于已知的配体-受体对，预测CAFs与T细胞之间的相互作用。

STARTRAC-dist分析： 使用 STARTRAC-dist测量组织中特定细胞簇的富集，Ro/e大于1表明富集，反之为耗竭。

结果

为了探索 neoICT前后 ESCC TME中的细胞组成，研究对18名患者不同时间点的样本进行了单细胞转录组测序分析（图1A，B）。研究根据已知的标记基因确定了11种细胞类型，并发现治疗后上皮细胞比例显著减少，而成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞等基质成分增加（图1C-H）。这种细胞组成的变化可能与不同治疗反应的异质性细胞浸润有关。此外，研究通过 inferCNV分析确认了恶性细胞的拷贝数不稳定，而其他基质细胞则相对稳定。

图1

单核吞噬细胞（MP）包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC），是TME的重要组成部分。为解析治疗前后TME的细胞组成，研究先将DC分为迁移性DC（migDC）、浆细胞样DC（pDC）、常规DC1型和2型（cDC1、cDC2）四种表型（图2A，B）。在治疗后，cDC2细胞明显增加，表明它在 ESCC的TME中可能发挥抗肿瘤作用（图2C，D）。然而，在pCR组和非pCR组之间，治疗样本中cDC2的比例没有显著差异（图2E）。接下来，研究通过聚类将巨噬细胞细分为7个亚群（图2F-H）。治疗后的肿瘤组织中MT1G TAM 显著减少，而LYVE1 TAM 显著增加（图2I，J）。非pCR组中MT1G的比例高于pCR组，而LYVE1的比例低于pCR组（图2K）。TCGA-ESCAd 队列的KM曲线显示MT1G TAM 具有预后价值。这些结果 表明 MT1G TAM 可能在ESCC中具有促肿瘤作用 。此外，治疗后的肿瘤组织中，静脉ECs比例显著增加，而毛细血管ECs和增殖ECs的比例显著降低。淋巴ECs的存在与不良的治疗反应相关。

图2

成纤维细胞是TME中的关键基质细胞类型。为解析ESCC中异质性CAF成分，研究将CAFs细分为六个亚群，包括三个机械反应性CAFs（mr-CAFs）亚群、一个免疫调节性CAFs（im-CAFs）亚群和两个稳态样CAFs（ssl-CAFs）亚群（图3）。研究还用多重IHC确认了与每个簇相关的基因。DH1B+CAF 和PI16+CAF 亚群表达较低的基质成分和炎症标志物，而αSMA+FAP+mr-CAF 和CD248+mr-CAF 亚群表达高水平的机械敏感信号介导的基质成分。im-CAF亚群则富含炎症相关基因和补体因子。这些发现有助于深入了解ESCC中纤维细胞的异质性及其在肿瘤微环境中的功能。

图3

为了进一步评估ESCC中异质性CAF亚群对新辅助抗PD1联合治疗的临床反应，研究比较了治疗前后的CAF亚群，发现 CD248+mr-CAF 和 IL6+CCL2+im-CAF 亚群在治疗后丰度显著增加，而αSMA+FAP+ 和αSMA+MKI67+mr-CAF 亚群在治疗前的丰度更高（图4A，B）。在六对治疗前后的样本中，αSMA+FAP+mr-CAFs 的比例显著下降，而 CD248+mr-CAFs 的比例上升（图4C）。组织病理学染色证实了治疗后αSMA+FAP+mr-CAFs减少（图4D，E）。进一步的分析显示，αSMA+FAP+mr-CAF 与多种癌症类型的不良预后有关。此外，CD248+mr-CAFs 在治疗后的肿瘤组织中形成了保护肿瘤细胞的物理屏障，与肿瘤细胞的免疫逃逸和治疗抵抗性相关（图4F-I）。

图4

为了进一步阐明CAF亚群对治疗反应差异的潜在机制，研究探索了六个CAF亚群的细胞轨迹和伪时序分析。根据RNA速率分析结果，αSMA+MKI67+和αSMA+FAP+mr-CAF被确定为CAF分化的起源（图5A）。伪时序分析显示，αSMA+FAP+和αSMA+MKI67+mr-CAF逐渐分化为CD248+mr-CAF和IL6+CCL2+im-CAF（图5B-D）。在CAF分化过程中，与αSMA+FAP+mr-CAF和αSMA+MKI67+mr-CAF相关的基因显著下调，而与IL6+CCL2+im-CAF相关的炎症相关基因显著上调（图5E，G）。转录因子分析显示，MAF（促进免疫抑制巨噬细胞极化的关键介质）在αSMA+FAP+mr-CAF中表达最高，ZMIZ1（促进肿瘤转移）在CD248+mr-CAF中的表达最高，FOXC1（促进侵袭和转）在IL6+CCL2+im-CAF中高表达（图5F）。这些发现表明，这三个CAF亚群可能与ESCC的不良预后相关。

图5

鉴于T细胞是TME中最丰富且异质最高的细胞类型，研究对7911个T细胞进一步聚类得到自然杀伤（NK）细胞和8个不同的T细胞亚群（图6A，B）。研究发现CD4和CD8的不同亚群具有不同的基因表达特征，如CD4和CD8 Naïve/中央记忆亚群高表达IL7R、TCF7、SELL和CCR7，表达FOXP3的调节性T细胞（Tregs）高表达IL2RA和IKZF2等。研究发现新辅助免疫化疗后，CD8+T细胞的浸润增加，但同时这些细胞表现出更高的衰竭状态（图6C-E、G）。总体而言，neoICT能够提升细胞毒性T细胞的功能，但也加速了CD8+T细胞的耗竭。此外，neoICT明显降低了肿瘤内的Tregs和耗竭T细胞的比例（图6F）。总之，neoICT重塑了免疫抑制的肿瘤微环境，使其从"冷"免疫景观转变为"热"免疫景观。

图6

为探究CAFs调节T细胞活性和功能的潜在机制，研究使用CellPhoneDB分析了ESCC治疗前后TME内细胞通讯变化。研究发现治疗后细胞互作明显增加（图7A）。在T细胞中，PD1的表达在治疗前较低，并且pCR组的PD1表达较非pCR组低，表明其具有“冷”肿瘤免疫环境，对联合治疗的反应相对较低（图7B）。治疗后，在pCR组中PD1等共抑制检查点和刺激分子CD27、CD40L上调，增强了T细胞抗肿瘤活性（图7B）。在治疗前，CD248+、IL6+CCL2+CAF与Tregs、耗竭T细胞间的CTLA4-CD86/80交互作用较高；在治疗后，这些交互减少，而TIGIT-NECTIN2的交互增加（图7C）。此外，Tregs和CAF之间的TIGIT-NECTIN2的相互作用在非pCR组中显著高于pCR组。这些结果表明TIGIT-NECTIN2可能是新辅助联合治疗中药物抵抗的关键配体-受体相互作用。

图7

结论