Plus深读 | I型干扰素和TNF共同控制巨噬细胞表观遗传影响免疫反应激活

1：TNF处理与LPS处理的关系

分别进行4种处理，RNA测序分析证实，TNF处理会影响LPS应答 (Fig.1a)：

在这些不同处理下，对基因表达变化pattern进行分类 (Fig.1b)：

耐受基因（tolerized genes，T genes）Class 1-2：LPS处理诱导表达，但TNF先处理后LPS就不能或很少影响诱导其表达；

不耐受基因（nontolerized genes，NT genes）Class 3-6：在TNF预处理后的细胞中，LPS仍旧能诱导其表达变化；

其中3：LPS处理诱导表达，而TNF处理无作用；

4-5：TNF处理诱导表达，加入LPS后表达进一步提升。

按照GO分类分析不同Class基因(Fig. 1c-e)：

1：免疫应答、NF-κB通路(Fig. 1c-e)

3：Jak–STAT相关的细胞因子和干扰素途径

4：SREBP转录因子的调控相关的脂代谢和胆固醇途径(Fig. 1c-e).

Fig. 1 TNF和LPS处理（TLR4）后细胞RNA测序分析

2：ChIP和ATAC测序分析TNF和LPS处理的影响的转录事件

ChIP分析的位点：

H4ac和H3K4me3，都与染色质打开和转录起始相关；

H2BK120，能够促进H3K4me3形成与染色质打开；

分别分析以上4种处理中表观遗传因子的结合、以及ATAC测序分析了转录起始情况，同样能够将下游基因分成不同Class。

举例：

IL6，class 1的T gene，LPS处理会促进H2Bub、H4ac和H3K4me3水平，并提升染色体亲和性（ATAC），从而提高RNA转录水平（Fig.2b）；而TNF预处理后LPS就不再能够促进H2Bub、H4ac和H3K4me3水平、ATAC，RNA转录水平也不会提升（Fig.2b）；

CCL5，class 3的NT gene，与cytokine–Jak–STAT信号传递相关，LPS、TNF、和两种处理都能够促进H2Bub、H4ac和H3K4me3水平、ATAC以及其RNA表达水平（Fig.2b）；

CH25H，class 4的NT gene，低浓度的LPS不能促进其表观遗传水平、以及RNA转录水平的剧烈变化，需要TNF的预处理，才能起始其染色质的打开（Fig.2b）。

Figure 2 4种处理对表观遗传修饰、以及染色质打开程度的影响

进一步对ATAC测序得到的染色质打开处的序列进行分析，找出产生功能的主要转录因子（Fig.2c,3a）。Footprinting分析PU.1/Ets转录因子发现，核心的起作用转录因子是NF-Y和SP-1，NF-κB则会被TNF处理等因素诱导起作用（Fig.3a）。Class 3的NT gene则主要被IRF控制表达，class 4的NT基因主要被AP-1控制（Fig.3a），并且AP-1蛋白在TNF刺激下稳定性显著增加（Fig.3b）。

与脓毒血症病人样本进行比较发现，class 1和2的T genes往往与恢复负相关（Fig.3d），然而class 3等NT基因则没有明显相关性。而风湿性关节炎（RA）的关节macrophage中class 3和4的基因表达也会上升，类似于TNF刺激的效果（Fig.3e-f）。

Figure 3 转录因子结合分析，以及与人类疾病的相关分析

3：Type I interferons抑制TNF作用

研究者进一步分析了IFN-α对于TNF和LPS刺激的影响，即采用1中的4个处理分别加上IFN-α的预处理以后，再进行RNA测序分析（Fig.4）。

举例：class 1 的T gene，在IFN-α预处理的前提下，无论TNF处理与否都能响应LPS刺激（Fig.4b）。

WB发现，LPS刺激会导致IκBα的降解从而增强NF-κB信号，TNF抑制IκBα的降解，然而IFN-α的加入又会再次导致IκBα降解，进而激活NF-κB信号通路，造成IKK和ERK通路的激活（Fig.4d）。以IL6为例，figures 4e-f证明IFN刺激能够促进Pol II的结合、从而增强RNA转录。

Figure 4 IFN-α，即I型干扰素能够抑制TNF的功能

4：TNF和IFN在T基因序列上面表观修饰水平的作用

Figure 5a针对上述RNA变化事件进行了染色体上转录事件的证明：LPS刺激能够促使IL6处染色体开放，TNF抑制后又能被IFN强烈激活。ATAC测序、以及H3K4me3、H2Bub的ChIP测序分析同样证明，IFN能够剧烈提升这些位点的转录活性（Fig.5b-e）。

Figure 5 IFN与TNF在染色体表观遗传标记水平的功能

5：分析受TNF和IFN刺激、调控class 1基因转录的转录因子

通过分析ATAC测序结果寻找转录因子，发现了NF-Κb和IRF共同结合的ISRE位点在ATAC、H3K4me3和H2Bub结合位点处都存在富集（Fig.6a-b），并且这些基因能被IFN刺激表达增强（Fig.6c）。

分别进行IRF1和p65的ChIP测序分析，发现TNF+IFN-α刺激后两者的结合位点大面积重合（37.56%，Fig.7a），例如IL-1B、CCL3和IL6等（Fig.7b-d）。

Figure 6 INF和TNF刺激下Class 1基因启动子上的转录因子分析

Figure 7 IRF1和p65在IFN和TNF刺激表达的基因序列上存在共定位

6：SLE患者的monocyte中染色质结构松散，起到类似于IFN刺激的作用

研究者利用SLE monocyte，进行上述的条件刺激、RNA测序、ChIP测序等分析实验，发现添加LPS刺激后，即表现出染色质打开、转录事件强烈激活的状态，类似于正常细胞中IFN+TNF+LPS多重刺激（Fig.8）。

Figure 8 SLE患者monocyte处理和测序分析

References:

文字和图片来自于：

Sung Ho Park et al. Type I interferons and the cytokine TNF cooperatively reprogram the macrophage epigenome to promote inflammatory activation. Nat. Immunol. doi:10.1038/ni.3818 (2017).

1. Kalliolias, G.D. & Ivashkiv, L.B. TNF biology, pathogenic mechanisms and emerging therapeutic strategies. Nat. Rev. Rheumatol. 12, 49–62 (2016).

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3. Ivashkiv, L.B. & Donlin, L.T. Regulation of type I interferon responses. Nat. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).

4. Smale, S.T., Tarakhovsky, A. & Natoli, G. Chromatin contributions to the regulation of innate immunity. Annu. Rev. Immunol. 32, 489–511 (2014).