巧妙！这篇Science，给分子测距！

高分子科学前沿 · 公众号 · 化学 · 2024-10-16 07:50

正文

聚脯氨酸螺旋二级结构作为尺子，给分子测距！

荧光显微镜由于其最小侵入性在理解生物分子的多种功能方面发挥了重要作用。然而，这一目标需要对蛋白质和其他生物分子的大小、关联及构象变化进行量化，进而要求精确测量分子间和分子内的距离（1~20nm）。自1960年以来，大分子距离通常通过弗尔斯特共振能量转移（FRET）间接推断，但由于其依赖于两个荧光团的相对取向和分子间的极化性，这使得精确测量变得复杂，且通常受限于2~8nm。

日前，德国马普所纳米生物光子学系 STEFAN W. HELL提出一种MINFLUX定位技术在室温下以0.1纳米级精度线性测定分子内距离。MINFLUX通过将已知的环形激发光束中心零点位置与未知的荧光团位置进行比较来确定荧光团的位置，这样就实现了所需荧光光子数量最小化；其定位精度与检测光子数量呈指数关系，因此需要检测的光子数量通常是相机定位精度的约100倍；光激活荧光团可以确保发射正交性，从而一荧光团发射时另一萤光团保持惰性；此外，圆偏振光定位使得荧光团定位独立于其取向。相关工作以“Direct optical measurement of intramolecular distances with angstrom precision”发表在《Science》上。

研究结果

为验证MINFLUX的可行性，该工作选择了聚脯氨酸螺旋二级结构作为参考距离，首先将光激活染料连接到聚脯氨酸链的两端，通过激光束激活，荧光团从非活性状态转变为发光状态，MINFLUX定位算法确保快速对准发射源，定位精度可达到亚纳米级，多个荧光团的激活显示其独立性，证明了荧光团间距离测量的可行性。

MINFLUX测试结果表明聚脯氨酸链中荧光团之间的距离分布范围为5nm-12nm。测得距离分布通常较宽，尤其是对于较长的聚脯氨酸，反映出肽链的灵活性。对于20个或更多脯氨酸残基，平均测得的距离与脯氨酸残基数呈接近线性关系，线性回归分析表明每个残基的增量约为0.21纳米。此外，y截距可能部分归因于端部甘氨酸和赖氨酸残基对荧光团的位移，以及荧光团的物理尺寸。总体而言，MINFLUX能够解析和量化整个分子内部距离的“梯子”结构。

图1. 埃级精度分子内距离的直接光学测量

该工作继续测量了C和N端标记的骆驼抗体末端距，C和N端之间的距离约为3.7nm。通过与末端半胱氨酸的马来酰亚胺偶联，少量疏水光活化染料Abberior CAGE 635被用作标记。MINFLUX技术有效地解析了这一间距，测得距离主要分布在2.5至5nm之间，峰值为3.8nm。测量结果中还存在一些较长的间距，分布在7-9nm和10-13nm的范围内，这表明可能存在抗体二聚体和三聚体，应是马来酰亚胺标记过程中自由半胱氨酸的二硫键桥接形成。梯度凝胶SDS-PAGE分析证实了二聚体和三聚体的存在，且在紫外光激活后观察到荧光。由于高空间分辨率，MINFLUX能够通过距离测量直接识别出低丰度聚合物。此外，二、三、四聚体的间距超过了FRET范围，这突显了MINFLUX测量距离超过10nm。

图3. 分子内距离测量：蛋白位点及蛋白质亚基的定位

该工作还表征了HaloTag与人类骨肉瘤细胞（U-2 OS）中Lamin A/C的N端融合。核层粘蛋白是形成中间纤维的纤维状蛋白，为细胞核提供结构稳定性并影响基因表达，其直径约为3.5nm，结构模型表明层粘蛋白的组装基于反平行二聚体的配对，导致形成均匀厚度的纤维。

在基底核膜的成像实验中，结合HaloTag的染料偶联配体显示出几何排列的标记位置，呈现沿一条线的分布，并观察到小间隔的配对。此外，MINFLUX可实现<10nm胞内测距。

图4. 细胞内标记蛋白距离的测量

分子内测距可用于大分子成像。分子结构通常统计为平均数据集，其灵活性无法体现，MINFLUX可通过对单个大分子的成像及映射出构象空间来揭示结构亚群体的存在。为证明，该工作研究了细菌柠檬酸传感器组氨酸激酶（CitA）的细胞质PAS结构域（PASc）同源二聚体。成像实验中，通过逐步光激活观察到的距离从小于1nm（平行二聚体）到约4nm（反平行二聚体）。倾斜的二聚体轴与平面之间存在垂直分量，提取距离为0-1 nm，精度达到亚埃级别。埃级精度的三维位置测量能够量化二聚体集合中的C端分布为欧几里得三维距离，识别出两个不同的亚群体，分别代表平行和反平行构型。因此，MINFLUX量化了亚群体的相对丰度。

图5. FRET范围内及以下的构象测量和埃级距离测量：蛋白二聚体的平行和反平行二聚体构象

小结

该研究提出的MINFLUX荧光团定位技术可达到约0.1 nm的精度，实现了荧光分子低至1nm的物理距离测量。其优势总结为（i）可使用已建立的荧光标记程序，（ii）比相机定位有效利用约100倍的荧光光子预算，（iii）避免分子取向效应和（iv）FRET偶极耦合。未来，MINFLUX应能将其优势扩展到更大的视野和活细胞中。

全文链接：
https://doi.org/10.1126/science.adj7368

来源：高分子科学前沿

声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！