细胞间
的直接
相互作用
对于
驱动许多组织的发育
至关重要，并且很难整合到
组织工程
支架中以进行组织修复。细胞聚集体，称为球状体，在组织工程领域越来越
受
关注，与分散在支架或水凝胶中的细胞相比，它们具有
固有的细胞间相互作用和强大的分泌能力
。由于单个球体的大小不足以用于支架的制备，因此许多研究已尝试利用细胞球作为
“
构建块模块
”
，单独使用或与生物材料一起用于制造宏观组织。
来自宾夕法尼亚大学的
Jason A. Burdick
教授团队将细胞球状体与类似大小的微凝胶相结合，制备了可注射的复合颗粒水凝胶并用于工程软骨组织的构建。
首先，研究人员结合细胞球和颗粒水凝胶的属性，将细胞球与微凝胶混合形成颗粒状复合材料，
可注射
到模具或组织损伤部位，引入有利于组织形成的
细胞
-
细胞接触和球状体融合
，并进一步通过光引发
颗粒间交联以形成稳定结构（图
1a
）。研究团队使用间充质
干
细胞
（
MSC
）
球和降冰片烯修饰的透明质酸（
NorHA
）微凝胶组合成高细胞密度颗粒复合材料（
>2
亿个细胞
/mL
）
，并
验证
了其
促进
工程
软骨组织形成
的作用（
图
1b
）。在研究颗粒复合软骨形成之前，
研究者
首先探究了单个
MSC
球如何在软骨形成培养基中生长。
MSC
球是通过将成年猪
MSC
接种到锥体微孔中来制备的，该微孔允许细胞在第
2
天凝聚。这些微孔允许生成数千个球体，控制
MSC
球体平均直径在
125-175 μm
（图
1c
）。
并
通过软骨特异性
细胞外基质（
ECM
），包括
COL II
、
硫酸软骨素（
CS
）和硫酸化糖胺聚糖（
GAG
）的组织学染色确认
了
ECM
沉积（图
1d
）。接下来制备大小类似的微凝胶。
HA
与降冰片烯修饰（即
NorHA
）形成微凝胶，以控制微凝胶交联密度和颗粒间交联，之后使用间歇乳液制备
NorHA
微凝胶，为了匹配
MSC
球体直径，使用
280 RPM
的乳液离心速度获得
约
140 μm
直径的
NorHA
微凝胶（图
1e
）。
在表征每种颗粒成分后，研究
者探究了
球状体和微凝胶的混合如何影响颗粒复合材料的形成和每种成分的连通性
，
这对于实现微凝胶颗粒间交联以实现初始构建体
的
稳定至关重要。在
C4D
中模拟了圆柱形管内球体和微凝胶的混合。模拟体化层叠复合材料允许生成二元
z-
堆叠，然后在
FIJI
中进行分析，并分离两个组分（图
2a
）。通过这种方法了解了球状体或微凝胶组分的连通性，以探究初始体积比如何影响稳定性和组织形成。球状体与微凝胶的低比率（
<50
：
50
）导致球状体连接性低，而球状体与微凝胶的高比值（
>50
：
50
）导致微凝胶接触减少（即有限的颗粒间交联），微凝胶连接性低。一般而言，在
35
：
65
球状体与微凝胶体积比中，微凝胶多分散性的增加降低了微凝胶的连通性，并增加了球状体的连通性
；
而球状体聚集的增加略微改变了微凝胶的连通性，但在
20
：
80
和
35
：
65
的球状体与微凝胶体积比组中，球状体的连通性有所增加
（图
2b
-
c
）
。
为了研究颗粒复合材料的潜在可注射性，测量了
20
：
80
、
35
：
65
和
50
：
50
球状体与微凝胶体积比的流变特性。球体和微凝胶首先分别离心和浓缩，然后混合形成复合材料（图
3a
）。混合后立即进行测试，以模拟注射到组织
损伤处
的情况。同时单独测量
MSC
球
体
或单独测量微凝胶（图
3b
），其中微凝胶的储存模量与单独的球状体相比增加
10
倍，屈服行为（
G“
）向更高的应变转变，这可能是由于负载下颗粒相互作用的差异引起的（图
3b
）。当测试复合材料时，在复合物中观察到类似的模量和屈服行为（图
3c
）。具体而言，当包含微凝胶时，各组的储能模量相似（
20
：
80
除外），而复合材料中的
损耗
模量比单独使用任一组分增加（图
3d
-
e
）。同样值得注意的是干扰条件（例如，离心速度）会改变微凝胶的填充和储存以及
损耗
模量，在配制复合材料时必须考虑这一点。
基于颗粒复合材料模拟结果和这些配方的可注射性，将复合
颗粒
转移到
3D
打印模具中，在可见光下暴露
3
分钟进行微凝胶颗粒间交联，然后从模具中取出进行培养，可以制造出球体与微凝胶比例为
20:80
、
35:65
和
50:50
的颗粒复合材料
（
图
4a
）
。为了可视化颗粒状复合材料，使用
RapiClear
清除结构，捕获共聚焦
z
堆栈，并在
Imaris
显微镜软件上进行
3D
重建
（
图
4b
）
。
20:80
和
35:65
颗粒复合材料在
力学性质
上都是稳定的。通过两组的三维共聚焦重建验证了预期的体积比，结果表明颗粒复合材料的体积比平均在
3%-5%
之间
（
图
4c
）
。
20:80
和
35:65
组的孔隙度都保持在
20%
左右
（
图
4d
）
。与
20:80
组相比，
35:65
组的孔隙面积
（
750-1250 µm
2
）
明显更小
（
图
4d
）
。
由于
20
：
80
和
35
：
65
的球状体与微凝胶体积比颗粒复合材料在颗粒间交联后立即可注射且稳定，因此选择这
一配方
在软骨形成培养基下培养长达
56
天（图
5a
）。鉴于先前关于球状体培养物随时间推移而坍塌并失去形状保真度的报道，使用颗粒复合材料直径和形状的监测来确保培养物的稳定性
，结果表明复合材料
在
56
天的培养期内都保持稳定性（图
5b
）。这表明
NorHA
微凝胶提供了足够的
力学
支持，以防止
MSC
球体在融合过程中
的
塌陷。为了评估软骨组织的产生，监测生化成分、生物力学特性
并进行
组织学
评估
。随着时间的推移，
dsDNA
水平在
20
：
80
和
35
：
65
的体积比中增加不显着，表明细胞活力没有剧烈损失；然而，到第
56
天时，与
20
：
80
组相比，
35
：
65
组的
dsDNA
含量明显更高，这很可能是由于初始细胞密度
的
差异（图
5c-i
）。随着时间的推移，两组的
GAG
和胶原蛋白都表现出显着增加，但
35
：
65
组的
ECM
比
20
：
80
组高出
约
50%
（图
5c
）。接下来，通过单轴压缩试验确定颗粒复合材料的抗压性能。在第
1
天时，
20
：
80
颗粒复合材料的模量比
35
：
65
组高
约
40%
，这是由于微凝胶颗粒间交联和微凝胶含量增加。随着时间的
推移
，两组的压缩模量都有所增加，直到第
56
天，
35
：
65
组（
580 kPa
）明显比
20
：
80
组（
450 kPa
）大
约
30%
（图
5d
）。这些结果与观察到的
ECM
含量增加一致，并表明单轴压缩特性的增加与
ECM
沉积的增加有关。值得注意的是，与
20
：
80
组相比，
35
：
65
组的细胞数量增加可能有助于增加
GAG
含量和压缩模量。此外，在初始
35
：
65
构建体中观察到的孔面积减少（同时保持整体孔隙率）可能会影响整体组织形成。为了进一步评估颗粒复合材料中的
ECM
沉积和分布，在
28
和
56
天对
GAG
和胶原蛋白进行染色（图
5e
）。
结果
表明，
35
：
65
组
GAG
和胶原
II
的面积增加了
约
1/4
，这意味着没有基质的空隙空间更少（图
5f
）。这些观察结果再次与测量的
ECM
水平一致，并且在
20
：
80
构建体中引入的更大微凝胶量可以限制
ECM
分布。
为了评估新软骨组织与周围天然软骨组织的整合，将
35
：
65
球状体与微凝胶比例的复合材料、单独的颗粒水凝胶和软骨塞对照在软骨环内离体培养
28
天，并通过推出测试整合
效果（
图
6a
，
c
）
。推出测试
结果
显示，在培养
28
天后，与单独的颗粒水凝胶对照（
约
20 kPa
）相比，
35
：
65
球体与微凝胶比例的颗粒复合材料表现出更高的整合强度（
约
60 kPa
）
。
然而，与所有条件相比，软骨塞对照表现出
最
强的整合（
约
170 kPa
）（图
6b
）
。这表明，
在颗粒水凝胶中添加
细胞
球通过培养形成的新软骨组织增加
与组织的整合
，而颗粒状水凝胶很容易从软骨环的中心移位（图
6c
-d
）。
综上所述，该研究
通过将
MSC
球体
和
NorHA
微凝胶组合
制备了
颗粒状复合材料，并验证了该系统在软骨组织工程中的应用。这种方法
兼具
了球状体和颗粒状水凝胶的理想特性，例如通过颗粒介质的剪切稀化和自愈特性实现的可注射性，通过微凝胶的颗粒间交联实现稳定性，细胞间接触促进
MSC
软骨生成，以及由于球状体融合和生长而形成的软骨组织。
本研究由
宾夕法尼亚大学的
Jason A. Burdick
教授团队
完成，于
2024
年
1
月发表于
A
dvanced materials
。
论文信息：
Nikolas Di Caprio, Matthew D. Davidson, Andrew C. Daly, and Jason A. Burdick
，
Injectable MSC Spheroid and Microgel Granular
Composites for Engineering Tissue
. Adv Mater 2024,
2312226
.
