细胞间的直接相互作用对于驱动许多组织的发育至关重要，并且很难整合到组织工程支架中以进行组织修复。细胞聚集体，称为球状体，在组织工程领域越来越受关注，与分散在支架或水凝胶中的细胞相比，它们具有固有的细胞间相互作用和强大的分泌能力。由于单个球体的大小不足以用于支架的制备，因此许多研究已尝试利用细胞球作为“构建块模块”，单独使用或与生物材料一起用于制造宏观组织。来自宾夕法尼亚大学的Jason A. Burdick教授团队将细胞球状体与类似大小的微凝胶相结合，制备了可注射的复合颗粒水凝胶并用于工程软骨组织的构建。
首先，研究人员结合细胞球和颗粒水凝胶的属性，将细胞球与微凝胶混合形成颗粒状复合材料，可注射到模具或组织损伤部位，引入有利于组织形成的细胞-细胞接触和球状体融合，并进一步通过光引发颗粒间交联以形成稳定结构（图1a）。研究团队使用间充质干细胞（MSC）球和降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA）微凝胶组合成高细胞密度颗粒复合材料（>2 亿个细胞/mL），并验证了其促进工程软骨组织形成的作用（图1b）。在研究颗粒复合软骨形成之前，研究者首先探究了单个MSC球如何在软骨形成培养基中生长。MSC球是通过将成年猪MSC接种到锥体微孔中来制备的，该微孔允许细胞在第2天凝聚。这些微孔允许生成数千个球体，控制MSC球体平均直径在125-175 μm（图1c）。并通过软骨特异性细胞外基质（ECM），包括COL II、硫酸软骨素（CS）和硫酸化糖胺聚糖（GAG）的组织学染色确认了ECM沉积（图1d）。接下来制备大小类似的微凝胶。HA与降冰片烯修饰（即NorHA）形成微凝胶，以控制微凝胶交联密度和颗粒间交联，之后使用间歇乳液制备NorHA微凝胶，为了匹配MSC球体直径，使用280 RPM的乳液离心速度获得约140 μm直径的NorHA微凝胶（图1e）。
在表征每种颗粒成分后，研究者探究了球状体和微凝胶的混合如何影响颗粒复合材料的形成和每种成分的连通性，这对于实现微凝胶颗粒间交联以实现初始构建体的稳定至关重要。在C4D中模拟了圆柱形管内球体和微凝胶的混合。模拟体化层叠复合材料允许生成二元z-堆叠，然后在FIJI中进行分析，并分离两个组分（图2a）。通过这种方法了解了球状体或微凝胶组分的连通性，以探究初始体积比如何影响稳定性和组织形成。球状体与微凝胶的低比率（<50：50）导致球状体连接性低，而球状体与微凝胶的高比值（>50：50）导致微凝胶接触减少（即有限的颗粒间交联），微凝胶连接性低。一般而言，在35：65球状体与微凝胶体积比中，微凝胶多分散性的增加降低了微凝胶的连通性，并增加了球状体的连通性；而球状体聚集的增加略微改变了微凝胶的连通性，但在20：80和35：65的球状体与微凝胶体积比组中，球状体的连通性有所增加（图2b-c）。
为了研究颗粒复合材料的潜在可注射性，测量了20：80、35：65和50：50球状体与微凝胶体积比的流变特性。球体和微凝胶首先分别离心和浓缩，然后混合形成复合材料（图3a）。混合后立即进行测试，以模拟注射到组织损伤处的情况。同时单独测量MSC球体或单独测量微凝胶（图3b），其中微凝胶的储存模量与单独的球状体相比增加10倍，屈服行为（G“）向更高的应变转变，这可能是由于负载下颗粒相互作用的差异引起的（图3b）。当测试复合材料时，在复合物中观察到类似的模量和屈服行为（图3c）。具体而言，当包含微凝胶时，各组的储能模量相似（20：80除外），而复合材料中的损耗模量比单独使用任一组分增加（图3d-e）。同样值得注意的是干扰条件（例如，离心速度）会改变微凝胶的填充和储存以及损耗模量，在配制复合材料时必须考虑这一点。
基于颗粒复合材料模拟结果和这些配方的可注射性，将复合颗粒转移到3D打印模具中，在可见光下暴露3分钟进行微凝胶颗粒间交联，然后从模具中取出进行培养，可以制造出球体与微凝胶比例为20:80、35:65和50:50的颗粒复合材料（图4a）。为了可视化颗粒状复合材料，使用RapiClear清除结构，捕获共聚焦z堆栈，并在Imaris显微镜软件上进行3D重建（图4b）。20:80和35:65颗粒复合材料在力学性质上都是稳定的。通过两组的三维共聚焦重建验证了预期的体积比，结果表明颗粒复合材料的体积比平均在3%-5%之间（图4c）。20:80和35:65组的孔隙度都保持在20%左右（图4d）。与20:80组相比，35:65组的孔隙面积（750-1250 µm2）明显更小（图4d）。
由于20：80和35：65的球状体与微凝胶体积比颗粒复合材料在颗粒间交联后立即可注射且稳定，因此选择这一配方在软骨形成培养基下培养长达56天（图5a）。鉴于先前关于球状体培养物随时间推移而坍塌并失去形状保真度的报道，使用颗粒复合材料直径和形状的监测来确保培养物的稳定性，结果表明复合材料在56天的培养期内都保持稳定性（图5b）。这表明NorHA微凝胶提供了足够的力学支持，以防止MSC球体在融合过程中的塌陷。为了评估软骨组织的产生，监测生化成分、生物力学特性并进行组织学评估。随着时间的推移，dsDNA水平在20：80和35：65的体积比中增加不显着，表明细胞活力没有剧烈损失；然而，到第56天时，与20：80组相比，35：65组的dsDNA含量明显更高，这很可能是由于初始细胞密度的差异（图5c-i）。随着时间的推移，两组的GAG和胶原蛋白都表现出显着增加，但35：65组的ECM比20：80组高出约50%（图5c）。接下来，通过单轴压缩试验确定颗粒复合材料的抗压性能。在第1天时，20：80颗粒复合材料的模量比35：65组高约40%，这是由于微凝胶颗粒间交联和微凝胶含量增加。随着时间的推移，两组的压缩模量都有所增加，直到第56天，35：65组（580 kPa）明显比20：80组（450 kPa）大约30%（图5d）。这些结果与观察到的ECM含量增加一致，并表明单轴压缩特性的增加与ECM沉积的增加有关。值得注意的是，与20：80组相比，35：65组的细胞数量增加可能有助于增加GAG含量和压缩模量。此外，在初始35：65构建体中观察到的孔面积减少（同时保持整体孔隙率）可能会影响整体组织形成。为了进一步评估颗粒复合材料中的ECM沉积和分布，在28和56天对GAG和胶原蛋白进行染色（图5e）。结果表明，35：65组GAG和胶原II的面积增加了约1/4，这意味着没有基质的空隙空间更少（图5f）。这些观察结果再次与测量的ECM水平一致，并且在20：80构建体中引入的更大微凝胶量可以限制ECM分布。
为了评估新软骨组织与周围天然软骨组织的整合，将35：65球状体与微凝胶比例的复合材料、单独的颗粒水凝胶和软骨塞对照在软骨环内离体培养28天，并通过推出测试整合效果（图6a，c）。推出测试结果显示，在培养28天后，与单独的颗粒水凝胶对照（约20 kPa）相比，35：65球体与微凝胶比例的颗粒复合材料表现出更高的整合强度（约60 kPa）。然而，与所有条件相比，软骨塞对照表现出最强的整合（约170 kPa）（图6b）。这表明，在颗粒水凝胶中添加细胞球通过培养形成的新软骨组织增加与组织的整合，而颗粒状水凝胶很容易从软骨环的中心移位（图6c-d）。
综上所述，该研究通过将MSC球体和NorHA微凝胶组合制备了颗粒状复合材料，并验证了该系统在软骨组织工程中的应用。这种方法兼具了球状体和颗粒状水凝胶的理想特性，例如通过颗粒介质的剪切稀化和自愈特性实现的可注射性，通过微凝胶的颗粒间交联实现稳定性，细胞间接触促进MSC软骨生成，以及由于球状体融合和生长而形成的软骨组织。本研究由宾夕法尼亚大学的Jason A. Burdick教授团队完成，于2024年1月发表于Advanced materials。论文信息：Nikolas Di Caprio, Matthew D. Davidson, Andrew C. Daly, and Jason A. Burdick，Injectable MSC Spheroid and Microgel Granular Composites for Engineering Tissue. Adv Mater 2024, 2312226.
