今天小维给大家分享两篇转录组+代谢组项目文章，文章一研究了外源脱落酸对干旱胁迫下茶树脂质和类黄酮代谢的影响。文章二研究了一氧化氮（NO）调节高羊茅镉胁迫适应的分子机制。视频解读和详细版文字解读如下，点击文末“阅读原文”还可以下载原文文献。
外源脱落酸对干旱胁迫下茶树脂质和类黄酮代谢的影响
期刊：
Scientific Reports
时间：
2020.7
IF：
3.998
2020年7月，青岛农业大学在Scientific Reports发表了名为“exogenous abscisic acid induces the lipid and flavonoid metabolism of tea plants under drought stress ”的研究论文。
本研究是基于代谢组和转录组学技术，分析了外源ABA对干旱胁迫下茶叶基因和代谢产物的影响
。
干旱是茶树的主要非生物胁迫，它不仅限制了茶树的产量，而且影响茶叶的品质。干旱胁迫下大量差异表达基因（DEGs）主要富集在挥发性化合物、黄酮类化合物、茶氨酸生物合成途径中，部分差异表达基因还参与叶片衰老。因此，探讨减轻干旱胁迫对茶树的影响的途径是十分必要的。目前，关于干旱胁迫对茶树影响的研究主要集中在茶树胁迫反应的机制上，包括形态、生理和分子水平的变化。脱落酸（ABA）是一种重要的植物激素，参与植物抗旱性的激活。干旱胁迫诱导ABA的生物合成，ABA是引发多种分子和细胞反应的信号，最终导致气孔关闭。研究表明，ABA无论是内源浓度还是外源施用都能提高植物的抗逆能力。
本研究利用转录组和代谢组学方法，分析了外源ABA对干旱胁迫下茶树基因和代谢产物的影响，有助于进一步了解茶树对干旱胁迫反应的分子机制
。
1、生理表型观察——茶叶在AT和SD下的生理变化。
为了研究外源ABA和干旱处理茶树的表型变化，我们拍摄了它们的胁迫表型（表现出明显的形态变化）。结果表明，在SD条件下，叶片出现了大量的萎蔫和卷曲现象（图1）。干旱胁迫下喷施ABA叶片的萎蔫和卷曲现象明显减轻，说明外源ABA在一定程度上缓解了干旱胁迫对茶树的伤害，维持了茶树的生长。
为了评价外源ABA对茶树生理特性的影响，我们检测了水分充足（CK）、轻度干旱（MD）、ABA处理（AT）和严重干旱（SD）下茶叶的几个生理指标。在AT和SD条件下，随着干旱处理时间的延长，总叶绿素（TC）和叶片含水量（LWC）均呈下降趋势，但AT处理比SD处理高。PSII的最大量子产率（Fv/Fm）也有相似的变化。在AT和SD条件下，MDA含量随着干旱处理时间的延长而增加，但AT处理的MDA含量低于SD处理。结果表明，外源ABA能减轻干旱胁迫下茶叶的脂质过氧化，防止叶绿素降解，维持光合作用。此外，还测定了3种内源激素的含量和4种抗氧化酶的活性，抗坏血酸过氧化物酶活性显著低于SD，CAT、POD和GR活性无差异，叶片内源ABA含量显著高于对照与SD处理相比，内源GA3含量显著降低，内源IAA含量无差异。结果表明，外源ABA可影响干旱胁迫下茶树内源激素和抗氧化酶的变化。
图1. CK、MD、AT和SD下茶叶表型变化。
KEGG途径富集分析表明，AT/MD中的DEGs主要富集在淀粉和蔗糖代谢、脂质代谢、植物病原相互作用、植物激素信号转导等方面。AT/CK中的DEGs主要集中在果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导和甘油脂质代谢。SD/MD中的DEGs主要集中在光合作用、氨基酸的生物合成、次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢等方面。SD/CK中的DEGs主要富集于光合作用、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。MD/CK中的DEGs主要集中在淀粉、蔗糖代谢和植物激素信号转导中。AT/SD中的DEGs主要富集在碳代谢、氨基酸的生物合成、次生代谢产物的生物合成。
KEGG富集分析表明，CK与其它组分之间存在着差异，三种处理主要富集能量代谢、氨基酸生物合成、脂质代谢和次生代谢产物的生物合成
。
图2. 不同治疗组间差异表达基因（DEGs）的统计。
2、转录组分析——外源ABA对干旱胁迫下茶树能量代谢和氨基酸代谢相关基因的影响。
在淀粉和蔗糖代谢方面，参与淀粉合成的基因在SD/MD和SD/CK中均显著下调，而AT/MD和AT/CK中均无变化或略有下调，包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、颗粒结合淀粉合酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）。淀粉降解相关基因在SD/MD和SD/CK中均上调，而AT/MD和AT/CK则无变化或略有上调，包括AMY（α-淀粉酶）和BAM（β-淀粉酶）。同样，参与蔗糖合成的4个SPS基因（蔗糖磷酸合成酶）在SD/MD和SD/CK中均下调，但在AT/MD和AT/CK中均无变化或略有下调。而蔗糖降解相关基因在SD/MD和SD/CK中均明显上调，而AT/MD和AT/CK则无变化或略有上调，如INV（转化酶）（图3）。
在糖酵解和TCA循环中，参与糖酵解和TCA循环的基因在SD/MD和SD/CK中均显著上调，但在AT/MD和AT/CK中均无变化或略有上调，包括糖酵解中的己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、磷酸果糖激酶（PFK）、磷酸甘油变位酶（PGAM）；柠檬酸ATPTCA循环中的合成酶（ACLY）、柠檬酸合成酶（CS）、乌头酸水合酶（乌头酸酶）、异柠檬酸脱氢酶（IDH）、琥珀酰辅酶A合成酶（SCS）（图3）。在氨基酸代谢方面，干旱胁迫下，大多数基因在SD/MD和SD/CK中均显著上调，而AT/MD和AT/CK在干旱胁迫下无变化或略有上调，包括酪氨酸转氨酶（TAT）、芳香酸脱氢酶（ADH）、谷氨酸脱羧酶（GAD）、谷氨酸合酶（GOGAT），天冬酰胺合酶（ASNS）（图3）。
图3. 淀粉、蔗糖代谢、糖酵解、TCA循环和氨基酸途径相关基因在CK、MD、AT和SD下的表达。
3、转录组分析——外源ABA对干旱胁迫下茶树脂质代谢相关基因的影响。
为了探讨外源ABA对茶树脂质代谢的影响，我们主要分析了干旱胁迫下茶树脂质代谢相关基因的表达。共筛选出81个与脂质代谢有关的DEGs，其中40个DEGs在SD/MD和SD/CK中均明显上调，而AT/MD和AT/CK均无变化或略有上调，包括二酰甘油激酶（DGK）、脂肪酰ACP硫酯酶B（FATB）、乙醇胺激酶（EKI）、磷脂酶D1/2（PLD1/2）。另外，39个DEGs在SD/MD和SD/CK中均显著下调，而AT/MD和AT/CK则无变化或略有下调，包括脂氧合酶（LOX2S）、12-氧代苯甲酸还原酶（OPR）、磷脂酰丝氨酸脱羧酶（PSD）、磷脂酰丝氨酸合酶（PTDSS）。此外，溶血磷脂酶（LYPLA）和亚油酸9S脂氧合酶（LOX1_5）仅在AT/MD和AT/CK中上调。
4、转录组分析——外源ABA对干旱胁迫下茶树苯丙素和类黄酮代谢相关基因的影响。
为了研究外源ABA对茶树苯丙素和类黄酮代谢的影响，我们分析了干旱胁迫下苯丙素和类黄酮生物合成相关基因的表达（图4）。结果表明，与苯丙酸生物合成有关的重要基因在SD/MD和SD/CK中均呈高度上调，而AT/MD和AT/CK中均无变化或略有上调，如肉桂醇脱氢酶（CAD）、4-香豆蔻酸-CoA连接酶（4CL）、阿魏酸-5-羟化酶（F5′H）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等。而与类黄酮生物合成相关的关键基因在SD/MD和SD/CK中均显著下调，而AT/MD和AT/CK则无变化或略有下调，包括F3′H、F3′5′H、FLS和DFR（二氢黄酮醇4-还原酶）。为了验证转录组测序数据的准确性和可重复性，随机选择10个DEGs通过qRT-PCR验证RNA序列数据（图5）。结果表明，RNA-seq和qRT-PCR的表达模式相似，说明RNA-seq数据是可靠的。
图4. 苯丙素和类黄酮代谢相关基因在CK、MD、AT和SD下的表达。
图5. 一组DEGs的qRT-PCR分析。
5、代谢组分析——AT和SD条件下类黄酮和脂质代谢的差异。
为了研究外源ABA对干旱胁迫下茶树叶片代谢产物的影响，对CK、MD、AT和SD顶部第二次完全膨大的叶片进行LC-ESI-MS/MS分析。共有65个DEMs（差异代谢物）（43个上调和22个下调）在AT/MD中获得，90个DEMs（54个上调和36个下调）在SD/MD中获得，81个DEMs（31个上调和50个下调）在AT/SD中（图6）。有趣的是，与SD/MD相比，AT/MD中大多数类黄酮的丰度显著增加，而大多数脂质代谢物的丰度显著降低。
对于类黄酮，AT/MD中大多数化合物（黄酮、黄烷酮、黄酮醇、异黄酮和花青素）明显增加（图4）。特别是在黄酮类化合物中，樱花苷的含量分别比AT/MD和SD/MD增加了13.15倍和11.06倍。沙棘皮素、刺槐苷、落叶松苷和丁香黄素仅在AT/MD时升高，芹菜素O-丙二酰己糖苷、飞燕草苷3-O-葡萄糖苷和花青素3-O-芸香苷含量在SD/MD时显著降低，山奈酚、山柰苷、4-甲基邻苯二酚的含量也显著降低，AT/MD的花青苷和黄颜木素均高于SD/MD。
脂代谢产物中涉及脂肪酸、甘油脂和甘油磷脂代谢的38种代谢物在干旱胁迫下发生明显变化。特别是lysop22:6的丰度较高，SD/MD和AT/MD分别增加了11.57和10倍。SD/MD组溶血素14:0、16:0、18:0、18:1、18:2（2n异构体）、15:1、16:0、17:0明显升高，而PC16:1/14:1和13 HOTrE仅在AT/MD时升高，13种代谢物仅在SD/MD时增加，如Lysop18:0（2n异构体），LysoPC 18:2（2n异构体）和MAG（18:1）异构体2。
图6. 不同处理组间差异代谢物（DEMs）统计（VIP≥1，FC≥2或≤0.5）。
6、基因与代谢产物的相互作用网络分析。
基因代谢物相互作用网络可用于帮助理解功能关系和帮助识别新的调控元件。在这里，我们对差异表达的基因和与类黄酮和脂质代谢相关的代谢物进行了Pearson相关试验。
进行了类苯黄酮和类苯黄酮生物合成的相关性分析。结果表明，43个DEGs与12种代谢物具有很强的正相关系数和负相关系数（R2>0.8或
对于脂质代谢，81个DEGs和38个DEMs均与脂质代谢相关，结果表明56个DEGs与34个代谢产物有很强的正相关和负相关（R2>0.8或
图7. 脂质代谢相关基因与代谢产物之间的连接网络。
转录组和代谢组分析揭示一氧化氮（NO）调节高羊茅镉胁迫适应的关键因素
期刊：
BMC Genomics
时间：
2020.8
IF：
3.594
2020年8月，中南民族大学资源与环境科学学院在BMC Genomics发表了名为“Comparative transcriptome combined with metabolome analyses revealed key factors involved in nitric oxide (NO)-regulated cadmium stress adaptation in tall fescue ”的研究论文。
本研究通过转录组学和代谢组学的比较研究了NO介导的镉胁迫反应的分子机制。
已有研究表明，一氧化氮（NO）可改善高羊茅镉（Cd）的毒性，但NO介导的Cd解毒机制尚不清楚。本研究通过转录组学和代谢组学的比较研究了NO介导的镉胁迫反应的分子机制。
镉（Cd）被认为是对所有生物最具毒性的金属之一。Cd的来源多种多样，人类活动加速了Cd向周围环境的释放。更重要的是，镉具有高度的溶解性和流动性，使其很容易进入食物链，从而对人类健康造成严重危害。当植物受到镉胁迫时，细胞氧化还原平衡被破坏，导致植物细胞中活性氧（ROS）的产生和爆发。因此，各种基因和代谢物被调控，并引发抗氧化系统、病原体防御、解毒机制、细胞程序性死亡和气孔行为等过程。一氧化氮（NO）是一种自由基反应性气体，是一种多功能信号分子。NO在植物的许多生理过程中起着至关重要的作用，如发芽、侧根发育、光合作用、植物激素调节以及细胞死亡和生长。尽管NO在植物重金属胁迫反应中的意义已被证实，但Cd胁迫与NO信号的相互作用以及NO介导Cd胁迫缓解的更全面的分子和代谢机制尚不清楚。高羊茅（Festuca arundinacea Schreb）是世界上最常用的冷季牧草和草坪草品种之一。根系发达，对各种环境变化适应性强。在最近的研究中，高羊茅对各种重金属（包括镉、铜、铅和锌）具有很高的耐受性和富集能力。高羊茅可作为镉累积土壤中的蓄积物种应用于植物修复。然而，内源性NO对高羊茅Cd胁迫的作用尚不清楚。因此，探讨NO介导的高羊茅Cd胁迫缓解的分子和代谢机制具有重要意义。
为了调查研究中使用的处理方法的效果，我们测量了NO含量（图1）。经双向方差分析和LSD检验，Cd处理与不施Cd处理的根系NO含量差异显著。在添加NO供体（SNP和T1处理）、NO生成抑制剂和NO清除剂（L-NAME+c-PTIO和T2处理）以及不添加NO供体、抑制剂或清除剂（对照组和Cd处理）组之间，NO水平也有显著差异。然而，在Cd×NO水平上没有显著差异。L-NAME+cPTIO处理的根中NO含量显著低于对照。与对照相比，单用SNP处理根中NO含量显著增加。此外，Cd处理植株根系中NO含量显著高于对照。Cd+NO供体SNP（T1）处理的植株NO积累量进一步增加，而Cd、L-NAME+c-PTIO（T2）处理的根系NO积累量分别明显低于Cd处理。以上结果表明，上述NO相关试剂处理和Cd处理能有效地影响高羊茅根内源NO含量。为了进一步研究一氧化氮调节的高羊茅镉胁迫适应，我们重点研究了对照组、镉处理组、T1处理组和T2处理组。高羊茅根的Cd含量在T1处理下比Cd单独处理减少了11%（图2）。与此相反，用c-PTIO和LNAME处理植株，Cd含量显著提高了24.2%。此外，Cd、T1和T2处理组的根干重和根长无显著差异，这可能是由于短时间（48h）处理所致（数据未显示）。结果表明，NO能有效降低高羊茅根中Cd的积累。
图2. 四种不同处理高羊茅根中镉含量。
2、转录组分析——探讨高羊茅中NO对Cd解毒的分子机制。
为探讨高羊茅中NO对Cd解毒的分子机制，采用转录组分析方法。构建了12个RNA-seq文库并进行了测序，以确定高羊茅根中对Cd胁迫有反应的DEGs。共检索到2005577份转录本。转录本长度为201～16784bp，平均长度为680bp。从这些转录本中共获得968924个单基因，平均长度为475bp，N50长度为560bp。根据从头组装，在T1与Cd比较中，共发现904个DEG（414个上调，490个下调），但T2与Cd比较中仅发现118个DEG（74个上调，44个下调）。此外，我们发现1482个基因（591个上调基因和891个下调基因）在Cd与对照组的比较中存在差异表达。同时，为了验证Illumina RNA序列的可靠性，选择了参与不同生物学过程的DEGs进行定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测。qRT-PCR结果与RNA-Seq有很强的相关性（r=0.8935），说明RNA-Seq作为dna序列分析是准确有效的。进行GO功能和富集分析，对DEGs的功能进行分类。结果表明，生物过程（BP）在GO类中最为丰富，代谢过程在这一类中占主导地位。分子功能（MF）是第二大富集项，氧化还原酶活性、金属离子结合和阳离子结合是最具代表性的GO项。细胞组分（CC）是GO分类中富集最少的一类。此外，与背景值相比，使用KEGG数据库的DEGs数量显著增加（q<0.05）。丰富的KEGG通路是用散点图法（图3）。根据富集因子，前8个富集途径分别是“二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成”、“牛磺酸和低金黄酸代谢”、“类黄酮生物合成”、“α-亚麻酸代谢”、“酪氨酸代谢”、“氮代谢”，“赖氨酸生物合成”和“硫代谢”途径。
图3. 高羊茅根对T1处理的反应的散点图分析。
3、代谢组学——外源NO改变了Cd胁迫下高羊茅中代谢物水平
采用LC-MS技术，对Cd胁迫下高羊茅中外源NO调控的差异表达代谢产物进行了鉴定。在T1与Cd比较中，共检测到823种代谢物。与Cd处理相比（VIP≥1、FC≥2或FC≤0.5）共有99种差异代谢物，主要包括氨基酸及其衍生物（14）、黄酮（18）、花青素（11）、酚酰胺（7）、有机酸及其衍生物（4）、糖（3）和其他（42）。在这些差异表达的代谢物中，65种代谢物上调，34种代谢物下调。此外，在T2组和Cd组中发现了131个差异表达的代谢物（45个上调和86个下调），而在Cd和对照组中发现了197个差异表达的代谢物（161个上调和36个下调）。此外，检测到的大多数化合物在NO处理后发生了变化，最显著的一组是次生代谢物，特别是花青素和黄酮。在T1与Cd的比较中，代谢物芍药苷（Fes0607）和漆叶苷（Fes1007）的水平分别上调360.7倍和99.9倍。然而，与对照组相比，Cd组牡丹苷的下调率高出2525倍。另一方面，在T1与Cd的比较中，黄酮代谢物金合欢素（Fes1079）和樱花素（Fes1078）在很大程度上下调。主成分分析（PCA）显示第一主成分和第二主成分分别占总方差的27.63%和14.27%。此外，第一主成分显示出对照处理和含镉处理（包括Cd、T1和T2）的分离。另外，第二个主成分表明样品被外源NO处理或抑制产生NO，PCA分析表明所有处理的样品都有明显的分离。同时，层次聚类分析（HCA）的结果表明，所有对照样品都聚为一个单独的组（图4）。相比之下，其他处理线并没有形成一个单一的簇。重要的是，两个Cd系和两个T2系以相同的方式聚集在一起，这表明NO水平可能低于Cd处理，更接近Cd处理。
图4. 高羊茅代谢产物的层次聚类分析（HCA）。
4、代谢组学与转录组学的相关性综述
利用代谢组学和转录组学数据对植物镉胁迫反应进行了相关分析。通过对所有数据的综合分析，重点分析了T1和Cd处理的相关基因和代谢产物。对T1和Cd处理的转录组和代谢组的综合分析表明，904个DEGs中有81个与代谢物具有丰富的相关性，主要包括GST、硝酸还原酶（NAD（P）H）、反式肉桂酸4-单加氧酶和ABC转运体。此外，检测到的255种代谢物得到富集，但只有15种代谢物表达不同。注释代谢物的数据以热图形式呈现。三组数据表明Cd胁迫下NO反应的差异。中间簇的代谢产物主要是氨基酸，尤其是L-焦谷氨酸（Fes0791）。在T1处理下的水平高于Cd处理。不同表达的基因和代谢物在相同的KEGG途径中富集，包括苯丙素生物合成、氮代谢、黄酮和黄酮醇生物合成以及ABC转运蛋白（图5）。DEGs主要参与抗氧化系统、次生代谢途径、氮代谢和金属离子转运机制，提示NO通过一系列防御机制减轻Cd胁迫。
分析了与次级代谢途径相关的转录本与代谢产物之间的相关性，如苯丙素生物合成（反式肉桂酸）、黄酮生物合成（异三叶草苷和金合欢素）和有机酸（2，5-二羟基苯甲酸）的转录本。另一方面，发现了与氮代谢和一些氨基酸生物合成（L-瓜氨酸、L-焦谷氨酸和丙氨酸）相关的途径。
为了更清楚地了解差异表达基因与代谢物之间的相互作用，我们选择将一些相关的差异基因绘制到相关代谢通路中。在T1与Cd的比较中，观察到苯丙素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等途径的相关性（图6）。与苯丙素生物合成相关的转录本与代谢产物反式-肉桂酸呈高度负相关。在反式肉桂酸至4-香豆素的合成区域，反式肉桂酸及其下游的编码基因CYP73A表达上调。反式肉桂酸含量的上调可能有助于CYP73A的转录增加。据报道，反式肉桂酸促进了植物的生长，与重金属处理的植物相比，表现出相反的效果。此外，一些相关的
DEGs（TRINITY_DN367754_c1_g1，TRINITY_DN359843_c1_g1，TRINITY_DN 359843_c2_g1，TRINITY_DN380055_c1_g4
和
TRINITY_DN380055_c1_g2）
不仅在T1 vs Cd条件下，而且在T2 vs Cd条件下也上调。值得注意的是，在T2组与Cd组比较中，异槲皮苷的水平增加了4倍多，而在T1组和Cd组中则相反。同时，编码CYP75A的基因位于异槲皮苷的上游，在T1与Cd的比较中下调。然而，编码CYP75A的基因在T2与Cd的比较中没有改变。因此，我们推测CYP75A基因表达下调可能间接导致异槲皮苷的下降。此外，有机酸2，5-二羟基苯甲酸表现出类似异槲皮苷的表达模式。所有相关基因都认为ADH1是一种乙醇脱氢酶，能催化丙酮酸转化为乙醇。此外，所有ADH1相关基因均上调，但只有类黄酮3′，5′-羟化酶（CYP75A）基因在T1处理中下调。
毫无疑问，NO供体SNP的应用将参与氮代谢。此外，据报道，施用SNP可以通过影响氮代谢来保护植物免受非生物胁迫。因此，在T1处理中，很明显发现了氮代谢的代谢组和转录组之间的相关性。在这种情况下，很明显，硝酸还原酶
（TRINITY_DN380554_c0_g2、TRINITY_DN348032_c3_g1
和
TRINITY_ DN367739_c0_g2）
在T1和T2条件下明显上调，L-瓜氨酸（无伴生产物）的浓度比Cd处理的浓度增加。一些参与NO生成机制的基因也发生了改变。精氨酸酶基因表达下调，部分硝酸盐或亚硝酸盐转运体（NRT）表达明显上调。同样，ABC伴侣家族的两个转运体成员（ABCB1和ABCC10）也显著上调。
图5. 高羊茅T1处理与Cd处理的差异表达相关基因和代谢物的直方图。
图6. 高羊茅T1处理与Cd处理部分通路相关区域的简化示意图。
总之，本研究通过代谢组和转录组的综合分析，对高羊茅中NO对Cd解毒的分子机制有了更深入的了解（图7）。NO能调节氮代谢相关基因和代谢产物的表达，以保护高羊茅抗Cd胁迫。此外，NO可增加CAT、GLT1、GSTs和ADH1基因的表达，降低等异槲皮苷和金合欢素的含量，说明NO参与了抗氧化系统的调控。另外，ABCB1和ABCC10等上调基因在NO施用时高度激活ABC转运蛋白相关代谢物（肉碱和L-丙氨酸）的合成，提示NO在调节ABC转运蛋白途径以改善Cd转运和解毒方面起着关键作用。此外，本研究未发现并讨论了次级代谢产物，特别是苯丙素、黄酮和黄酮醇的生物合成。综上所述，一氧化氮通过增加抗氧化能力、释放更多的次生代谢产物用于镉螯合和螯合以及调节重金属转运蛋白来改善镉胁迫诱导的损伤。
图7. 高羊茅中一氧化氮（NO）调节的镉胁迫反应模型
