第一作者说 | 首次揭示T细胞淋巴瘤的表观遗传调控机制

中国科学技术大学瞿昆教授课题组联合美国斯坦福大学Howard Chang实验室，以共同第一作者、第一单位的身份在Cancer Cell上发表了题为“Chromatin accessibility landscape of cutaneous T cell lymphoma and dynamic response to HDAC inhibitors”的文章。该论文以T细胞淋巴瘤(CTCL)为研究对象，利用ATAC-seq技术，首次揭示了CTCL的疾病特异性、患者特异性及细胞特异性表观遗传调控机制，并首次发现了个性化(personalized)表观遗传调控机制对抗癌药物敏感性的决定性作用，说明对癌症表观遗传基因组研究的重要性。

CTCL是一种由T淋巴细胞克隆性增生造成的较为罕见的复杂性疾病，晚期的CTCL，如Sézary综合症，癌细胞可以转移至血液，导致T细胞白血病，是一种非常致命的疾病，然而此前对该疾病基因表达调控的研究还很匮乏。目前，美国药监局（FDA）已批准的组蛋白脱乙酰酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor, HDACi），如Vorinostat和Romidepsin等药物靶向患者的表观遗传基因组来治疗Sézary综合症。理论上，这两种药物都是希望通过抑制细胞内组蛋白脱乙酰酶的作用，提高细胞染色质的乙酰化水平，松弛核小体结构，从而增强各种转录因子和协同因子与DNA的特异性结合，激活基因，尤其是肿瘤抑制基因的转录，以此来抑制肿瘤生长、达到治疗疾病的目的。然而，由于临床样品稀少，传统实验技术，如DHS-seq等并不能实现检测微量人类活体细胞的染色质开放位点，因此我们并不清楚患者在接受HDACi抗癌药物治疗后，染色质是否真如所期望的那样被打开？肿瘤抑制基因是否有被激活？当然也无从知晓是否存在肿瘤特异性，甚至患者特异性的表观遗传指纹？如果有，那它又是如何调控患者对药物的敏感性？这些问题的解答，都将有助于医生为患者选取最佳的临床治疗方案。

基因表达调控是遗传和表观遗传修饰共同作用的复杂系统，表观遗传基因组通过组蛋白的位置、重排和化学修饰、DNA甲基化、非编码RNA的表达、以及转录因子调控网络等各种因素一起工作来决定细胞表型。由于各种调控原件大多作用于DNA转录活性位点，因此对表观遗传基因组研究的一个核心问题是如何在全基因组层面确定染色质开放位点。ATAC-seq是一种利用Tn5转座子插入到染色质开放位点的双链DNA，并随后建库测序的技术，该技术可以快速准确的检测全基因组DNA转录活性位点、DNA-蛋白相互作用、核小体分布等表观遗传信息。ATAC-seq的优点是灵敏度高，只需要五百到五万个细胞，实验时间短，从建库到数据初步分析完成，只需要十个小时，因此非常适合对少量临床样本的研究。

本文作者通过流式分离正常人和患者新鲜血液中的CD4⁺ T细胞，利用ATAC-seq技术快速检测正常人和患者血液中微量活体T淋巴细胞的染色质开放位点，整合各类组学数据和生物信息分析技术，深度解析CTCL表观遗传指纹，构建CTCL肿瘤特异性、患者特异性和细胞特异性基因调控网络。作者还通过追踪患者在组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）抗癌药物治疗过程中各个时间点的表观遗传状态，首次在时间尺度上深入研究表观遗传基因组和关键性转录因子对患者药物敏感性的动态调控机制，并准确预测患者对HDACi抗癌药物的敏感性。

文章分别从实验数据的可靠性，肿瘤细胞的特异性表观遗传指纹，关键性的调控因子，对HDACi抗癌药物的应答特异性等方面进行阐述。

1）揭示CTCL的表观遗传指纹，构建疾病特异性和患者特异性基因调控网络。

利用流式分选提取出CD4⁺T细胞，对部分具有可识别T细胞受体变异β的患者样品，通过流式细胞仪成功的分选出患者的宿主和肿瘤细胞（图1A，B），并顺利建库。结果显示在各个组分（正常、宿主、混合及肿瘤细胞）、各个患者（P11-P1409）中ATAC-seq信号均非常清晰且具有很强的信噪比，此外和H3K27Ac ChIP-seq信号也非常吻合，说明ATAC-seq技术的确检测到了T淋巴细胞DNA上的转录活性位点（图1C）。

通过比较正常、宿主、混合及肿瘤细胞的表观遗传图谱，发现数千个DNA调控位点存在显著性差异，并且可以明显的聚类成三个不同的簇，显示正常细胞、健康人和CTCL肿瘤细胞特异性的表观遗传指纹（图2A）。例如，在PIK3R1基因的内含子里面有两个DNA调控位点，在正常和宿主细胞中更开放，印证了先前关于PI3K/Ark信号通路缺失引起Sézary综合症的认识；对于在病原体识别和先天免疫激活中起着关键性作用的基因TLR4附近的调控位点，只在健康人的T细胞中开放，说明患者T细胞部分免疫功能缺失。相反，在基因HDAC9附近，却发现多个DNA调控位点只在混合或肿瘤细胞处于活跃状态（图2B-2D）。对基因组的分布特性的进行微分，包括五个基因功能元件：启动子、转录区、活性增强子，弱增强子和异染色质（图2E）。

图2. CTCL肿瘤细胞特异性表观遗传指纹

通过比较正常和混合CTCL 、宿主和肿瘤细胞之间的共同的差异性的位点来定义CTCL的表观遗传特征指纹（图3A）。正常和肿瘤细胞之间的表观遗传变化是高度一致的（图3B）。 以IFNG基因为例，在正常和宿主细胞中该基因的调控位点明显比混合和肿瘤细胞中要更开放，RNA-seq数据也证明该基因在宿主和肿瘤细胞中的表达量存在显著性差异（图3C）。并且总体上讲，基因周围的染色质越开放，基因的表达量越高（图3D），说明染色质开放程度和RNA表达量之间存在关联性。

图3. 染色质开放程度和RNA表达水平显著相关

通过对具有显著性差异的DNA转录调控位点进行motif分析，并利用Genomica中的ModuleMap算法，作者发现多个关键性转录因子，如PU.1、GATA、RUNX、STAT等调控细胞正常分化的转录因子富集在正常细胞和样品中，说明CTCL可能是一个正常功能丧失型的疾病（图4A）。相反，在患者样品中，除了已知的NF-kB转录因子会导致T细胞淋巴瘤，并且富集在几乎所有的患者样品中，作者发现不同的患者样品中还富集其他不同的转录因子motif，例如CTCF、Jun-AP1、以及以EGR、SMAD、MYOD、MYC和KLF为代表的转录因子群。这三个转录因子群在患者样品中的富集方式互斥，说明导致患者疾病可能存在不同的机制。通俗的说“幸福的家庭（指正常人）都一样，不幸的家庭（指患者）却各有各的不幸”。作者还将富集的motif及其相应的转录因子按照它们的显著性排序，找到对维持细胞正常功能以及导致细胞癌变的关键性转录因子（图4B），以及几个关键性转录因子在不同细胞类型中不同的motif-footprints（图4C）。

图4. 调控CTCL的关键性转录因子

2）研究患者特异性表观遗传状态如何决定患者对HDACi抗癌药物的敏感性。

在现有的8位患者中，有6位分别通过口服Vorinostat和静脉注射Romidepsin接受治疗，还有2位在不同时间分别接受两种药物治疗（图5A，B）。通过比较患者在接受药物治疗前后的染色质构象，作者发现：所有接受Vorinostat治疗的患者的染色质都没有被广泛打开，临床上这些患者对Vorinostat不敏感；部分注射Romidepsin的患者的染色质有被显著打开，临床上他们对Romidepsin敏感，而部分患者的染色质没有被打开，临床上他们对Romidepsin不敏感。通过系统性的研究染色质开放程度和药物敏感性之间的关系，作者发现染色质开放程度的变化和患者对药物的敏感性显著相关（图5C）。

图5. HDACi药物治疗下的患者个性化染色质动态变化

T淋巴细胞存在多种细胞亚群，作者利用CIBERSORT方法解析了正常、宿主、混合以及肿瘤细胞中各主要亚群的比重，发现Treg和Th2细胞亚群在混合和肿瘤细胞中明显富集，说明这两类细胞有可能主导了CTCL中T细胞的癌变（图6A，B）。此外，作者发现：同一患者（P11）在接受不同药物（Vorinostat和Romidepsin）后的染色质构象变化是不同的；不同细胞（混合、宿主和肿瘤）在接受同一药物（Romidepsin）治疗下的染色质构象变化也是不一样的（图6C）；此外，相对于混合和肿瘤细胞，宿主细胞在接受药物治疗后的反应更接近于CTCL表观遗传指纹。这些结果暗示：同一患者对不同药物的临床反应可以在染色质构象层面得到显示；存在细胞特异性的药物反应机制；那些在接受药物治疗后症状得到缓解的患者可能是通过使宿主细胞变得更正常得到治愈的。

图6：细胞种群特异性HDACi药物反应

3）整合基因组和表观遗传数据绘制CTCL的遗传变异图谱。

通过ATAC-seq数据对正常、混合、宿主、肿瘤细胞的DNA拷贝数进行分析，利用人类染色体图显示人类基因组DNA的拷贝数在各细胞类型中的差异。作者证实了在混合和肿瘤细胞中多个已被报道的遗传变异，如chr4q、chr8q和chr17q的增加，chr10q和chr17p的缺失等，并发现这些变异并没有发生在正常人或者患者的宿主细胞中（图7A，B） 。有趣的是，作者发现遗传层面的DNA拷贝数差异并不能反映患者对药物的敏感性，相反，表观遗传层面的转录因子调控机制（图4A）却可以准确的预测患者对药物的应答情况（图7C，D），再一次说明对患者表观遗传基因组研究的重要性。

总结：

该论文是首个通过直接获取CTCL患者活体T细胞，通过ATAC-seq获得肿瘤特异性、患者特异性和细胞特异性表观遗传指纹的工作。通过跟踪研究患者在接受HDACi抗癌药物治疗后DNA转录活性位点的动态变化，结合患者对药物的反应，文章实时构建了癌症个性化表观遗传调控网络，发现了调控细胞癌变的关键性转录因子，为新的靶向治疗方案提供依据，也为研究其他疾病的个性化表观遗传调控机制建立模板。综上所述，通过类似方法，大规模收集临床样本，发展和利用最新的实验和分析技术，从时间和空间尺度深入系统的研究人类疾病的表观遗传基因组，具有鲜明的特色和创新性，并将对推动精准医疗的发展有非常重要的科学意义。