看高分文章，重要的并不是在于会看懂上面有几张图，或者做了什么实验。重要的是要分析这篇文章的整体思路是什么，通过什么样的假设以及假设的迭代，一点点起承转合完成了这么一篇文章，然后分析这篇文章的优点和不足（假设和假设的迭代，就是一篇文章或者一个课题推进的动力，不清楚假设或者假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》），是否能给我们有所提示。今天讲的这篇文章，就是四川大学华西医院张惠媛团队，发表在25.5分的Cell大子刊Immunity上的文章。这篇文章讲的是HIF2α对于Th2的极化诱导，还是挺有意思的，我们就一起来看一看吧：
他们研究的是哮喘和慢性鼻炎，上来他们就先做了一个单细胞测序（这单细胞测序的UMAP图大家应该都熟悉了吧，这个是通过单细胞测序后，将基因转录的情况作为多重主成因，降维后的结果，也就是每个细胞亚簇都有一些基因表达作为标签，不清楚的话，可以去看看《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》），通过对CD4+ T细胞分析后，他们发现了两个关键点：一个是这些CD4+ T细胞中，对于哮喘和慢性鼻炎致病的Th2细胞中的一个亚簇；第二点就是只有这个致病的Th2细胞亚簇中Epas1（HIF2α）表达增多：
于是他们提出了第一个假设，既然HIF2α在致病的Th2细胞亚群中表达增多，是否其位于Th2细胞致病的激活上游？（假设的提出，意味着对现有结果以及现有已知信息的分析，通过对已知信息的归纳法总结，提出一个可以证伪的假设，这就是推动研究的第一步，不清楚归纳法以及假设提出的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）为了验证这个假设，他们对小鼠的CD4+ T细胞中使用Cre-LoxP敲除HIF2α，然后诱导哮喘的验证。结果发现特异性敲除了CD4+ T细胞中HIF2α，可以有效缓解哮喘的炎症症状，并减少CD4+ T细胞的Th2细胞亚群，炎症因子的分泌：
那么HIF2α的敲除，对于致病性的Th2的细胞亚簇分化，是否会有什么样的影响呢？他们接着还是进行了一轮单细胞测序，这轮单细胞测序是在特异性敲除了CD4+ T细胞中的HIF2α后进行的。这里可以明显发现，特异性敲除了CD4+ T细胞中的HIF2α后，致病的Th2细胞的分化明显降低了（这也就是柯霍氏法则的验证，通过移除上游关键因素，发现下游的表型产生的变化，一般也都是通过反向遗传学来进行验证的，不清楚柯霍氏法则和反向遗传学的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。也就是说HIF2α对于这一类致病的Th2细胞亚簇的分化，起到了关键作用。既然是单细胞测序，他们也检测了一下伪时间轴，也就是按照细胞中基因的表达顺序进行了排列，结果发现HIF2α对于致病性Th2细胞的极化，起到了关键作用：
那既然HIF2α与致病性Th2细胞的极化的极化有关，那么就需要进一步分析对于Th2细胞极化过程中，更上游的具有干性的Th2细胞是否会受到HIF2α影响。假设到了这里已经在不知不觉中产生了迭代，也就是从原有的“HIF2α可能位于Th2细胞激活的上游”，迭代成了“HIF2α可能是诱导干细胞样的Th2细胞向Th2细胞分化的关键因素”（这两个假设其实是在迭代的过程中，逐渐缩小了命题的外延，从而推进了研究的进展，不清楚假设迭代以及命题外延的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。通过单细胞测序，他们将Th2细胞的各个亚型进行了分簇，从中找出了具有干细胞特征的Th2细胞C0亚簇，也就是致病性Th2细胞的起源。而特异性敲除了HIF2α后，干细胞样的Th2细胞C0也产生了变化，细胞的分化方向，变成了Ikzf2+的Th2细胞分化增多，致病性Th2细胞分化降低。而在免疫缺陷小鼠中，移入野生型T细胞则会造成炎性反应增强，而移入特异性敲除了HIF2α的CD4+ T细胞后，炎症反应降低：
那么HIF2α的作用机制到底是什么呢？而通过单细胞测序，他们也发现了一个有趣的现象，HIF2α的表达，基本上与致病性Th2细胞的标志蛋白GATA3表达一致。大家要是还记得HIF1信号通路的话，就应该记得HIF其实是作为转录因子存在的（HIF1α和HIF2α应该算是近亲了，对于HIF信号通路不熟悉的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的缺氧诱导因子信号通路，复习下），而Th1、Th2的细胞分化过程中GATA3对于Th2细胞分化又起到了至关重要的作用，而GATA3也是个转录因子。于是他们就提出了一个新的假设，假设HIF2α可能对于GATA3具有协同的转录作用。通过对于HIF2α和GATA3结合的染色质部分，以及下游转录基因的比较。他们确定了，在致病性Th2细胞分化的过程中HIF2α和GATA3有协同作用：
由于PI3K-AKT信号通路在致病性Th2细胞亚群中激活过程中，有着重要作用，他们就想看看在HIF2α和GATA3的协同转录影响中，是否会影响PI3K-AKT信号通路的激活？于是，他们对Th细胞进行了HIF2α敲除的细胞，进行了分析。结果发现敲除了HIF2α后，AKT的磷酸化激活程度降低。但这两者之间的联系在哪儿呢？他们分析发现HIF2α会转录激活IPMK，这个蛋白是将PIP2转换为PIP3的（如果熟悉PI3K-AKT信号通路的话，就应该知道PI3K-AKT信号通路，就需要通过PI3K产生PIP3才能激活AKT磷酸化，不熟悉PI3K-AKT信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）。也就是说HIF2α和GATA3通过调节IPMK的转录，促进PIP3合成从而激活PI3K-AKT信号通路：
最后他们试图用HIF2α的抑制剂，做一下临床应用的验证。结果发现，HIF2α的抑制剂的确可以通过抑制致病性Th2细胞的分化，从而缓解气道炎症：
然后，就形成了这样的示意图，HIF2α通过与GATA3的协同作用，促进了IPMK的激活，产生大量的PIP3，从而激活PI3K-AKT信号通路，使之产生致病性的Th2细胞分化，导致了炎症反应：
整篇文章，其实在推进的过程中，都是表现得不错的。多次的单细胞测序使用，说明在工作量和经费上都是投入了大量的成本的。但其实在最后，机制的应用上，他们使用了IPMK的抑制剂进行了验证，虽然无可厚非，但也算是一个小小的不足。在这里的机制验证，如果能通过突变破坏IPMK启动子上HIF2α与GATA3协同作用的位点，这样就可以有效避免肯定后件的逻辑谬误（由于直接采用抑制剂的话，并不能说明HIF2α与GATA3协同作用和IPMK之间的直接关系，所以会产生肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以去看看《列文虎克读文献》、《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。总的来说这篇文章通过单细胞测序，逐步推进到Th2细胞亚群分化的过程，是十分值得借鉴的，但可能就很花钱……好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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