实验方案（图1A）：在第0天，从糖尿病NOD小鼠中分离所需材料，将MSC，EVs（3mg或30mg）或PBS通过静脉注射IV的方式，注射进入NOD / scid小鼠(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)。在第4天，再次治疗。予高糖喂养，每周进行两次高血糖监测，具有血糖>250mg/dL的小鼠定义为糖尿病，如（图1B）所示， MSC衍生的EVs和MSCs两者都显着延迟了T1D模型小鼠T1D发病时间。
图2： MSC衍生的EVs在胰岛中抑制胰岛炎
（图2A）是上图的动物在第58天（EV治疗组）和第50天（MSC治疗组）处死，搜集胰腺组织和血液，做HE染色，箭头表示胰岛浸润性免疫细胞，在PBS处理的小鼠中剩余的胰岛显示严重的胰岛炎，而MSC衍生的EVs或MSC能抑制胰岛炎和保留胰岛细胞。（图2B）定量检测，分别代表每个载玻片胰腺数、胰岛浸润评分。（图2C）是胰岛炎评分、胰岛素量化，胰岛素在血浆中的表达，通过用EVs或MSC处理我们看到胰岛素血浆水平显着增加。另外和组织学相似，EVs或MSC治疗的小鼠胰岛中CD4 +细胞较少，而在PBS处理的小鼠胰岛存在大量CD4 +细胞（图2D），说明治疗后炎症浸润减少。
图3：MSC和MSC衍生的EVs阻止小鼠EAU的发展
（图3A）实验方案：在第0天，通过皮下IRBP注射和腹膜内百日咳毒素注射诱导EAU,诱导后向尾静脉注射MSCs或MSC衍生的EV，PBS做对照。在第21天，收集眼球和引流淋巴结用于测定。在PBS处理的EAU小鼠视网膜和玻璃体腔中，第21天视网膜横截面显示视网膜感光体层严重破坏和炎症细胞浸润（图3B），包括CD3 +T细胞出现（图3C），右图分别是视网膜组织学疾病评分和CD3免疫染色定量。通过MSC或MSC衍生的EVs治疗，CD3 +T细胞的数量明显减少，视网膜感光体层存在性好。
图4：EAU小鼠中MSC衍生的EVs抑制Th1、Th17发育
类似的，在MSC或MSC衍生的EV治疗中的小鼠的眼睛组与PBS治疗对照组相比（图4A），促炎细胞因子的转录水平，干扰素γ（IFN-g），白介素（IL）-17A，IL-2，IL-1b，IL-6和IL-12A明显降低，而IL-4和IL-10的mRNA水平不受治疗的影响。此外，流式细胞术检测显示IFN-g + CD4 +细胞和IL-17 + CD4 +细胞的数量在MSC或MSC衍生的EVs治疗中显着降低（图4B）。这些数据表明，MSC衍生的EVs同样能有效抑制Th1和Th17细胞发育和功能，并防止EAU疾病进展。
图5:在MLR中MSC衍生的EVs抑制Th1和Th17发育
作者接下来进行了MSC衍生的EVs对免疫细胞活化的影响研究，用同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）来测定。在MLR中，MSC衍生的EVs显着降低IFN-g，IL-12p70，IL-6和肿瘤坏死因子α的产生（TNF-α）（图5A），这表明MSC衍生的EVs抑制Th1的发展。而IL-6作为关键因子，能促进下游的IL-17进而介导Th17细胞产生，表明MSC衍生EVs也可以抑制Th17的发展（图5B）。作者进一步探讨MSC衍生的EVs是否通过抑制Treg调节细胞影响Th1和Th17发育。然而，MLR显示FOXP3+Treg在第6天没有增加（图5C），IL-10，诱导Treg的细胞因子，在MLR的第5天也没有增加（图5D），表明EV通过直接抑制Th1和Th17发育，从而抑制T细胞增殖而不是诱导Treg调节细胞。
图6:在MLR中MSC衍生的EVs抑制APC和T细胞激活
为了研究EV对APC激活的影响，作者在EVs共培养条件下检测共刺激因子（CD80，CD86和CD40）和主要组织相容性复合物（MHC）II类。（图A和B）代表流式细胞术图，（图C）是CD86、CD40、MHC-II型阳性细胞和CD80的定量检测，结果表明，EV和APC（CD11c+细胞）共培养后，抑制共刺激因子和MHC II类的表达。MSC衍生EV治疗显着增加了IL-10的水平在MLR第2天（图6D）。为了探究EVs是否直接抑制APC激活，作者换老鼠重复MLR，如图所示（图6E），EV治疗仍然抑制共刺激因子和CD11c +细胞中的MHC II类的表达。这些数据表明，APC表现出低反应性表型，从而抑制后续T细胞在MLR中的增殖。进一步检查EV是否也直接抑制T细胞活化，从小鼠脾细胞中分离出CD4 + T细胞用CD3 / CD28刺激它们。结果IL-2和IFN-g水平降低，说明EV治疗也抑制T细胞活化（图6F）。
