一文读懂 PCR 技术，从基础到高手进阶（附 96 页进阶资料）

生物制品圈 · 公众号 · 生物 · 2025-01-30 12:59

正文

一、前言

本文详细梳理了 PCR 技术知识，包括其定义、原理、操作步骤、类型、用途等。此外，还有一份 96 页的 PCR 进阶 PDF《How to Become a PCR PRO》，若你有需要，留言即可获取，记得关键词是“2025新年好”。下面是该 PDF 的目录：

二、什么是 PCR？

PCR 即聚合酶链反应，是一种核酸扩增技术，能在体外快速复制 DNA 或 RNA 片段，就像 “分子影印”。1983 年，美国生物化学家 Kary Mullis 突发灵感，后来这项技术让他在 1993 年获诺贝尔化学奖。

该技术基于细胞内 DNA 复制原理，以 Sanger 的 DNA 测序为基础发展而来。1976 年发现的热稳定 Taq DNA 聚合酶，为 PCR 奠定基础。此前，因普通聚合酶无法耐受高温，每次扩增都需添加新酶。Taq 酶能耐受高温，使 PCR 可多次循环扩增，更高效便捷。1985 年，《科学》杂志首次描述 PCR 技术，1993 年首个 FDA 批准的 PCR 试剂盒上市，此后 PCR 不断改进。

三、标准 PCR 实验概述

PCR 用于从复杂起始材料中扩增特定 DNA 片段，部分技术无需预纯化 DNA 或 RNA，但需知道待扩增片段两侧序列信息。

实验所需的 5 种关键试剂为：

模板 DNA：来源多样，如基因组 DNA、cDNA、质粒 DNA 等。
DNA 聚合酶：常用 Taq 聚合酶，适用于标准 PCR。新一代聚合酶性能更优，有的可减少非特异性扩增，有的具有 “校对” 功能。
引物：是短单链 DNA 片段，设计时要避免与相似序列结合，保证熔融温度相似，防止形成二级结构或引物二聚体，可借助在线工具设计。
dNTP：包含四种碱基核苷酸，等摩尔量添加用于合成新 DNA 链。
PCR 缓冲液：含氯化镁、tris - HCl、氯化钾，维持反应最佳条件。

将试剂混合放入热循环仪，经历变性、退火、延伸三步为一个循环，通常重复 30 - 40 次。

变性：95°C 加热使 DNA 双链分离。
退火：冷却至 50 - 65°C，引物与模板 DNA 结合，退火温度需根据引物优化。
延伸：升温至 72°C 左右，DNA 聚合酶合成新链。

反应结束后，常用凝胶电泳检测扩增是否成功，根据实验目的，PCR 产物可能是终点，也可能用于后续测序、克隆等研究。

四、PCR 变体

定量实时 PCR（qPCR）：可实时监测扩增并定量，借助荧光染料（如 SYBR® Green）或荧光探针（如 TaqMan 探针），随着目标 DNA 增加，荧光增强，通过标准品实现定量，使用带荧光检测系统的热循环仪。
逆转录 PCR（RT-PCR）和逆转录定量 PCR（RT-qPCR）：用于病毒 RNA 分析和定量。RT 是将 RNA 转为 cDNA 的过程。RT-PCR 有一步法和两步法；RT-qPCR 同样分一步法和两步法，先逆转录再 qPCR 扩增。
数字 PCR（dPCR）和数字液滴 PCR（ddPCR）：基于有限稀释，将反应分成众多小分区扩增，dPCR 根据分区结果分析，ddPCR 利用水油乳剂形成分区，2011 年推出，用于新冠检测等。
微流控 PCR：利用微流体技术，在芯片上扩增 DNA，具有速度快、试剂消耗少等优势，适用于即时检测，样品流经微通道经不同温度区完成循环。

五、各种 PCR 优缺点

六、PCR 的应用

研究应用：用于基因转录研究、基因分型、克隆和诱变、测序等实验，在基因工程、生物研究等方面意义重大。
多学科应用：在基因研究中，助力基因转录分析、生物基因序列操纵、基因分型等；医学上用于疾病诊断、产前基因检测、植入前遗传学诊断；法医学中用于亲子鉴定、法医调查、真实性测试；环境微生物学和食品安全领域用于病原体检测。

PCR 技术应用广泛，改变了众多学科研究方式，是现代科学研究的重要工具。

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