新手指南：如何规划我的CRISPR实验

生物通 · 公众号 · · 2017-06-09 15:51

正文

请到「今天看啥」查看全文

话说生物圈这几年最火热的技术，绝对非CRISPR莫属。这种新颖的基因组编辑技术凭借层出不穷的研究进展、热闹非凡的专利纷争，牢牢占据了各大杂志的头条。也许你也开始心动，希望尝一下“头啖汤”，但是纷涌而出的成果又让你不知从何下手。那么，现在就跟随我们，来规划一下你的CRISPR实验吧。

首先，你要考虑一下为什么使用CRISPR系统。永远破坏基因表达或功能（敲除）？表达突变型的基因（点突变）？还是增加或减少目标基因的表达？一旦你心中有数，那么后面就好办了。

CRISPR用于哪方面？

不同的遗传操作需要不同的CRISPR组件。确定了你的用途，相应地也就缩小了实验试剂的范围。需要注意的是，尽管这里介绍的内容主要针对哺乳动物细胞，但是许多原则也适用于其他物种。如果你挑选不到完美的质粒，可尝试一下独家定制。

遗传操作	应用	Cas9	gRNA	其他考虑
敲除	永久破坏特定细胞或生物体中的基因功能	Cas9 （或 Cas9 切口酶）	一条（或两条） gRNA ，靶定 5’ 外显子或重要的蛋白结构域	切口酶的方法提高特异性，但不够高效
编辑	在特定基因中生成用户指定的序列改变	Cas9 （或 Cas9 切口酶）	一条（或两条） gRNA ，靶定待编辑的区域	需要 DNA 模板进行同源指导修复。与敲除相比，效率有所降低
抑制（ CRISPRi ）	降低特定基因的表达，而不永久修饰基因组	dCas9 或 dCas9- 抑制子（如 dCas9-KRAB ）	gRNA 靶定目标基因的启动子元件	对哺乳动物细胞系， dCas9-KRAB 比单独的 dCas9 更加高效
激活（ CRISPRa ）	提高特定基因的表达，而不永久修饰基因组	dCas9 或 dCas9- 激活子（如 dCas9-VP64 ）	gRNA 靶定目标基因的启动子元件	目前有许多种不同的激活子

表达系统如何选？

CRISPR听上去并不复杂，只是在你的目标细胞中表达gRNA和Cas9。这个表达系统的选择就要取决于你的具体应用了。假如你的细胞比较容易转染，像HEK293细胞，那么标准的转染试剂可能就足以表达gRNA和Cas9。对于一些较难转染的细胞，病毒导入不失为一个好选择。下表总结了一些主要的表达系统。

表达系统	组件	应用
哺乳动物表达载体	Cas9 的启动子可以是组成型（ CMV 、 EF1 α、 CBh ），也可以是诱导型（ Tet-ON ）； U6 启动子通常用于 gRNA 许多载体包含报告基因（如 GFP ），以鉴定或富集阳性细胞；或包含选择标记，以生成稳定的细胞系	在可轻松转染的哺乳动物细胞系中瞬时或稳定表达 Cas9 和 / 或 gRNA
慢病毒转导	Cas9 和 gRNA 放在一个慢病毒转移载体上，或分布在不同载体上许多包含报告基因（如 GFP ）或选择标记，以鉴定和富集阳性细胞包装和包膜的质粒为形成慢病毒颗粒提供了必要的元件	在各种哺乳动物细胞中稳定表达 Cas9 和 / 或 gRNA 利用 CRISPR/Cas9 开展全基因组筛查的理想选择
AAV 转导	只适用于 SaCas9 （包装容量约为 4.5 kb ） CRISPR 元件可插入 AAV 转移载体中，产生 AAV 颗粒	瞬时或稳定表达 SaCas9 和 / 或 gRNA 感染分裂和非分裂的细胞 AAV 是毒性最小的方法，适合体内应用
Cas9 mRNA 和 gRNA	包含 gRNA 和 Cas9 的质粒可通过体外转录反应，产生成熟的 Cas9 mRNA 和 gRNA ，然后导入目标细胞（显微注射或电穿孔）	CRISPR 组件的瞬时表达随着 RNA 的降解，表达降低可用于生成转基因胚胎
Cas9-gRNA 核糖核蛋白复合物	经过纯化的 Cas9 蛋白和体外转录的 gRNA 可形成 Cas9-gRNA 复合物，并利用阳离子脂质体导入细胞	CRISPR 组件的瞬时表达随着 gRNA 和 Cas9 蛋白的降解，表达降低

如何设计gRNA？

一旦你选好了CRISPR组件和导入方法，下一步就是选择目标序列，并设计gRNA了。

首先，你要了解你的细胞系和基因组序列，这关乎实验的多个因素。如果可能的话，你应当在设计gRNA之前，对计划修饰的区域进行测序，因为gRNA目标序列和真实序列之间的差异可能会影响切割效果。

之后，你就要确定对基因组中的哪个区域进行敲除或改造。这个具体位置将取决于你的特定应用。比如：

▪ 在利用dCas9-激活子或dCas9-抑制子来激活或抑制目标基因时，gRNA应当针对目标基因的启动子区域。

▪ 在敲除基因时，gRNA通常靶定5’端组成型表达的外显子，这样就降低了目标区域被剪接掉的可能性。同时，这个区域的移码突变也比较容易产生无功能的蛋白质。

▪ 或者，可以让gRNA针对那些编码重要结构域的外显子。这样做的好处是，插入或缺失（通常由双链断裂产生）等非移码突变更可能改变蛋白质的功能。

▪ 若使用同源指导修复（HDR），则目标序列必须靠近待编辑的位置。在这种情况下，你必须确定编辑发生的确切位置，并选择附近的目标序列。

预测“on-target”活性

大家都知道，在Cas9结合目标DNA时，PAM序列是必不可少的。因此，你必须确定待靶定的遗传区域内所有的PAM序列（SpCas9的PAM是5′ NGG 3′）。如果此区域内没有PAM序列，你可能要考虑另一物种的Cas9或SpCas9的的变体。一旦确定了所有PAM序列和假定的目标位点，下一步就是选择切割效率最高的位点了。

显然，gRNA需要与目标序列匹配，但同时，又要确保它与基因组内的其他位点不匹配。如果这样的话，那就是完美！不过，现实情况是，基因组内总有几个部分同源的位点。这些位点就被称为“off-target（脱靶）”。当PAM序列的附近存在错配时，脱靶位点通常不会被有效切割。

除了“off-target”活性，我们还有必要考虑切割目标序列的活性 –“on-target”活性。假设有两条gRNA，每条都与目标DNA 100%同源，但它们的切割效率却未必相同。举个例子，第20位（PAM上游1 bp）是G的gRNA可能比相同位置是C的gRNA更有效。因此，在设计gRNA时，有必要仔细确认每条gRNA的on-target和off-target活性。这时，你可以利用一些成熟的gRNA设计软件，或参考已发表的文献。

合成和克隆gRNA

到了这一步，相信大多数人都会松一口气，毕竟最困难的部分已经过去了，下面都是大家熟悉的环节。通常，人们利用限制性酶切连接，将gRNA克隆到质粒中。具体的克隆策略将取决于你选择的gRNA载体。

导入Cas9和gRNA

你的导入方式早在选择表达系统时就已经决定了。不过，在将gRNA和Cas9导入细胞时，仍有必要优化一下操作，因为转染效率会随着导入方法和细胞类型而变化。

验证遗传修饰

现在就到了验收成果的时候了。你的细胞中可能有一部分是突变细胞，还有一部分是野生细胞。这是因为部分细胞缺乏gRNA或Cas9的表达，或表达后没有有效的切割。经过修饰的细胞可能是纯合的，也有可能是杂合的。此外，非同源末端连接（NHEJ）容易出错，因此每个突变的等位基因也许都不同。即使是同源指导修复，但是大量的双链断裂仍然由非同源末端连接来完成。因此，这个异质的细胞群将包含各种各样的突变和编辑。怎么办？你需要验证。

▪ 错配裂解法（适用于NHEJ）：对混合细胞中突变等位基因的百分比进行半定量。将感兴趣的区域进行PCR扩增，然后将产物变性，用切割DNA异源双链的核酸酶处理，然后跑胶鉴定DNA片段。

▪ PCR和限制性酶切（适用于HDR）：适用于引入新颖的限制性酶切位点的小范围核苷酸编辑。将感兴趣的区域进行PCR扩增，用适当的限制性内切酶消化，然后跑胶鉴定DNA片段。

▪ PCR扩增和凝胶电泳（适用于HDR或NHEJ）：适合大的插入或缺失。利用目标区域两侧或跨越插入片段边界的引物进行PCR扩增。电泳分析PCR产物，以确定编辑是否成功。

▪ PCR扩增、亚克隆和Sanger测序（适用于HDR或NHEJ）：半定量地评估编辑的效果和等位基因的确切序列。将感兴趣的区域进行PCR扩增，亚克隆到质粒中，再筛选单个克隆。

▪ PCR扩增和新一代测序（适用于HDR或NHEJ）：半定量地评估基因组编辑，也可用来研究脱靶效应。

至此，基因组编辑的工作才算大功告成。当然，我们这个指南只是提供了一个框架，供你参考。CRISPR/Cas9技术发展如此之快，新的方法和应用还在不断涌现。每个人都要不断学习，才能跟上它飞速发展的脚步。

利用CRISPR技术需要注意哪些关键点

如何利用CRISPR/Cpf1系统实现多重基因编辑

专家指南：如何选择CRISPR设计软件

专家指南：CRISPR实验中如何选择sgRNA

CRISPR操作指南进阶版：如何精确有效完成实验