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电场处理与铜对细菌灭活的协同效应研究

BCML速递 · 公众号 · · 2024-08-22 21:25

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传统消毒工艺大多数都依赖于氯和抗生素等化学物质，但氯基消毒剂易于形成具有致癌性的消毒副产品。抗生素也广泛应用于消毒，然而，由多重耐药细菌引起的感染数量正在增加，抗微生物药物耐药性对临床治疗造成了重大威胁。基于此，来自佐治亚理工学院的Xing Xie教授团队探讨了电场处理（EFT）与铜离子协同作用在细菌灭活中的潜在应用，鉴于EFT作为一种新兴技术，通过电穿孔机制有效灭活病原体，结合铜离子的天然抗菌特性，研究者设计了一种EFT-Cu系统用于抗菌，并搭建了一个LOAC（lab-on-a-chip）器件，用于放大并原位观察EFT-Cu系统的微观杀菌机制，阐释EFT与Cu的协同杀菌原理。

首先，研究者提供了对本研究中使用的实验室芯片（LOAC）设备的全面视图，包括其设计、制造过程以及在细菌灭活协同效应研究中的应用。数字照片和显微镜图像展示了LOAC设备的尺寸和金电极层的细节，以及通过显微镜观察到的单个通道的曲线电极设计（图1a）。制造流程说明了如何利用光刻和剥离技术在玻璃基板上沉积金电极（图1b）。COMSOL Multiphysics模拟和曲线电极的线性电场强度图示共同揭示了在通道中产生的电场分布（图1c-d）。差分干涉对比（DIC）图像和荧光图像显示了在电场作用下细菌的固定和灭活情况，其中灭活细胞因PI阳性染色而呈现红色（图1e-f）。整体灭活百分比与电场强度的关系图进一步量化了灭活效果，并通过误差条展示了95%置信区间，为理解电场处理和铜离子协同作用提供了实验数据支持（图1g）。这些图像和数据共同证明了LOAC设备在微观尺度上研究电场处理和铜离子协同灭活细菌的潜力和精确性。

接着，研究者又探究了电场处理（EFT）结合不同浓度铜离子（Cu）对细菌灭活效率的影响。不同脉冲宽度（500 ns、1 µs 和 2 µs）下，随着铜浓度的增加，灭活百分比在达到特定电场强度阈值后迅速上升，表明电场强度是影响EFT-Cu协同作用的关键因素。在2 mg/L Cu条件下，电场强度达到大约30 kV/cm时，灭活效率从约35%急剧上升至100%（图2a-c）。在较高电场强度范围内，不同铜浓度对灭活百分比的具体影响，以及对应的线性拟合线，揭示了铜浓度增加时总灭活值的明显提升（图2d-f）。通过计算线性拟合线的斜率值，定量分析了EFT和Cu协同剂量反应，即每增加1 mg/L铜浓度，灭活百分比的增加量。这些斜率值随着电场强度的增加而提高，证实了EFT-Cu之间存在显著的协同效应，尤其是在电场强度较高时，该协同效应可以使灭活效率显著提高（图2g-i）。

之后，研究者通过荧光显微镜图像和定量分析，直观地呈现了电场处理（EFT）单独使用、铜离子（Cu）单独使用以及EFT和Cu联合使用对细菌灭活效率随时间变化的影响。在没有EFT仅使用2 mg/L Cu的条件下，随着时间的推移，荧光强度逐渐增加，显示出死亡细胞数量的增加（图3a）。相反，在仅使用EFT的条件下，在电场强度最强的中心区域迅速实现了高效灭活，但随后荧光细胞数量没有显著增加，表明EFT诱导的灭活是一个快速且一次性的过程（图3b）。而在EFT和Cu联合处理的条件下，观察到的灭活效果更为显著，尤其是在电场强度较高的区域，EFT诱导的灭活迅速发生，而Cu诱导的细胞死亡则在整个通道中发生（图3c）。图3d展示了不同条件下灭活百分比随时间的定量变化，这些结果不仅证实了EFT和Cu结合使用时的协同增强效果，而且揭示了Cu的自然残留效应与EFT结合后，可以实现更快的整体消毒性能。特别是，在较高电场强度下，EFT-Cu的协同效应能够显著提高灭活速率，比单独使用EFT或Cu的预测效果更快。图3d中不同电场强度下灭活效果的变化，为优化EFT-Cu的消毒性能提供了重要的实验依据。

最后，研究者通过荧光和差分干涉对比（DIC）显微镜图像，深入分析了在电场处理（EFT）和铜离子（Cu）单独或联合作用下，细菌细胞膜的渗透性变化。在仅铜离子处理条件下，细胞显示出由铜离子渗透引起的荧光染色，但达到完全染色的过程相对较慢，大约需要44秒（图4a）。相比之下，在仅电场处理条件下，高电场强度迅速损伤细胞膜，允许染料快速扩散，导致在大约3.3秒内迅速达到染料饱和（图4b）。而在电场和铜离子联合处理条件下，细胞在脉冲移除后几分钟内达到完全染色，显示出比单独使用铜离子更快的染色速率（图4c）。图4d至f展示了荧光强度随时间的相对变化，其中图4d显示Cu-only条件下荧光强度的缓慢而稳定增加，图4e显示EFT-only条件下细胞迅速达到染料饱和的非线性趋势，图4f则展示了EFT-Cu条件下荧光强度的增加呈现出慢速开始后迅速上升至完全饱和的趋势。这些观察结果表明，EFT和Cu的联合作用显著提高了细菌细胞膜的渗透性，加速了细胞的灭活过程，从而证实了EFT和Cu之间存在协同效应，能够提高细菌的灭活效率。

综上所述，EFT-Cu系统的协同杀菌显示出巨大的应用前景，今后可重点研究将EFT与其他消毒剂和消毒技术相结合的潜在增强/协同杀菌作用，此外，本研究利用芯片实验室设备在微观层面观察和量化了EFT与铜离子的协同灭菌效果，旨在为开发安全、可持续的微生物灭活技术提供科学依据，并为未来的技术优化和应用提供指导。

本研究由佐治亚理工学院的Xing Xie教授课题组完成，于2024年2月发表于Nature communication。

论文信息：Mourin Jarin, Ting Wang, Xing Xie*. Operando investigation of the synergistic effect of electric field treatment and copper for bacteria inactivation. Nat. Commun 2024,15: 1345.

供稿：石家旭

审校：陈嵩

编辑：江浩