线粒体作为能量代谢的工具，其实研究的方向还是挺多的，线粒体自噬可能也只能算是一个比较小的点，但要做好，其实也并不容易。今天这篇文章是中山大学肿瘤医院的博士生，发表在14.6分的Autophagy上的文章，这篇文章讲的是MANF的高表达与线粒体自噬之间的关联性（
线粒体自噬，就是通过自噬途径，将ROS产生后，受到损伤的线粒体降解的过程，通过这个过程，可以清除细胞内的ROS，不熟悉线粒体自噬的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的线粒体自噬以及自噬相关章节
）。这篇文章的有点就是在研究的过程中，机制方面的分析，比其他很多十多分的文章而言，更为严谨，我们就来看看他们都做了点什么吧：
他们首先发现在乳腺癌细胞系受到了葡萄糖饥饿诱导后，乳腺癌细胞内的MANF的表达会明显增加。为了确定MANF在葡萄糖饥饿中所扮演的角色，或者说分析MANF的功能，他们对乳腺癌细胞进行了MANF的敲减（
这其实就是柯霍氏法则的验证，通过敲除某个基因，来分析该基因敲除后，对于表型的影响，在这里他们分析的是敲减MANF后，对于细胞在葡萄糖饥饿的情况想所产生的细胞增殖等表型，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》
）。结果发现敲减了MANF后，乳腺癌细胞在葡萄糖饥饿的条件下，细胞活力下降，ROS增多，而使用了GSH或者NAC抑制ROS产生后，可以回复敲减MANF后葡萄糖饥饿条件下，乳腺癌细胞的细胞活力。MANF的表达主要是在细胞质和细胞核中，而MANF与ROS产生联系的话，其表达位置应该在细胞质，需要定位到产生ROS的线粒体上。而MANF在SUMO化后，才会进入细胞核。于是他们分析了MANF在葡萄糖饥饿环境下的SUMO化修饰情况，结果发现葡萄糖饥饿后，MANF的SUMO化下降。那么什么蛋白可以对MANF去SUMO化呢？他们筛选后发现SENP1的表达，在葡萄糖饥饿后增多，敲减了SENP1并增加SUMO1后，会导致MANF的核易位：
线粒体中ROS会被MANF清除，而清除线粒体中ROS的途径，最常见的就是线粒体自噬。于是他们就提出了假设，假设MANF能通过诱导线粒体自噬来促进葡萄糖饥饿后产生的ROS清除（
提出假设是一篇文章的关键，假设是建立在已有研究或者实验结果的基础上的，他们通过分析了MANF的定位以及对于ROS的清除功能，提出了现在这个假设，而这个假设也是一个可以证伪的命题，不清除科研假设、科研推理过程以及可证伪性的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》
）。通过验证他们得到了这么几个关键的信息，首先MANF敲减后，葡萄糖饥饿后的线粒体自噬被抑制了。然后，在MANF的SUMO化位点突变后，线粒体自噬通量增加。另一方面在使用了自噬抑制剂之后，过表达MANF也没能挽救葡萄糖饥饿后细胞的活性。这三个证据，说明了MANF的SUMO化或者说其核易位，与线粒体自噬有密切的关系，而线粒体自噬又是细胞存活的关键。接着他们又分析了FAO（脂肪酸β氧化），由于葡萄糖饥饿环境下，细胞需要获得能量，就要通过FAO。而MANF的表达增加，也促进了乳腺癌细胞在葡萄糖饥饿后的FAO过程：
MANF并不会直接参与到线粒体自噬中，通过coIP，他们发现MANF能与参与线粒体自噬的PRKN（
其实就是Parkin，这个是线粒体自噬中和PINK一样重要的一种蛋白，Parkin是一种E3泛素化连接酶，通过泛素化修饰，促进线粒体自噬，不清楚线粒体自噬通路或者泛素化修饰通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列
）相互结合。通过分段克隆后的coIP，他们确定了两者结合的位置。另一方面Parkin的表达，则与葡萄糖饥饿环境下的ROS产生，线粒体自噬以及细胞活性也有着密切的关系。在葡萄糖饥饿条件下，乳腺癌细胞表现出高水平的Parkin氧化，而MANF则能有效抑制Parkin氧化，并促进Parkin泛素化：
MANF与Parkin结合的结构域中，有一段可能参与抗氧化的CKGC基序。为了确定MANF的CKGC基序对于Parkin的氧化抑制的作用，他们对这段序列进行了突变，将半胱氨酸突变成了丝氨酸，也就是MANF-SKGS（
这个过程通过对于MANF氨基酸的突变，来抑制MANF的潜在的，抑制Parkin氧化的功能，从而来分析MANF对于Parkin的作用，这一点上这篇文章做的是很出色的，通过这样的突变，缩小了概念的外延，尽可能的避免了MANF整体敲除所带来的肯定后件的逻辑谬误，使得这一部分的验证更为严谨，不清楚肯定后件逻辑谬误或者概念的外延和内涵的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）。结果显示，MANF的CKGC基序在葡萄糖饥饿条件下，抑制乳腺癌细胞中的Parkin氧化，从而促进线粒体自噬。
最后，他们进行了动物模型的体内实验，查看MANF高表达对于乳腺癌细胞的肺转移影响，以及预后。并通过临床数据，确定了高表达MANF对于乳腺癌患者预后生存较差的相关性：
最后就形成了这样的示意图（
这个示意图就是夏老师随手画的，具体的画法，在《夏老师带你读文献》里也都介绍过，有兴趣的画可以去看看，自己试试看
），葡萄糖饥饿环境下，线粒体损伤造成了ROS的累积，一方面促进了SENP1的表达，另一方面促进了Parkin的氧化。SENP1表达增强后，MANF的SUMO化被抑制，导致其无法入核，并产生了线粒体定位。MANF定位到线粒体后，结合了Parkin，并通过MANF的CKGC基序，抑制了Parkin的氧化，从而激活了线粒体自噬。线粒体自噬则为清除细胞内ROS，并促进乳腺癌细胞存活奠定了基础：
这篇文章在验证的过程中，能通过突变（
包含了MANF的SUMO化位点突变，以及CKGC基序突变等，来进行分析，极大低提高了这篇文章的严谨性，不清楚科研推理的严谨性的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
），来进行功能及表型的验证，这一点上来说就已经很难得了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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