前沿热点 | 鲁凤民：新型抗HBV核苷（酸）类似物的研发机遇或将到来

全球有慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者超过2.96亿人，是病毒性肝炎的主要病因。而我国就有慢性感染者8000多万人，每年新诊断的HBV感染相关肝癌更是占到了全球一半以上，严重危害国人健康。目前临床上可及的抗HBV药物包括直接抗乙肝病毒药物核苷（酸）类似物（nucleos(t)ide analogues, NAs）和长效干扰素两类。现有的NA类药物多来自抗HIV药物的扩大适应症应用，部分接受一线NAs治疗的慢性乙肝（chronic hepatitis B，CHB）患者常有低病毒血症（low level viremia, LLV）的发生，提示其对HBV复制的抑制作用有限。加之该类药物对HBV基因组共价闭合环状DNA（covalently closed circularDNA, cccDNA）并无直接作用，作为病毒复制源头的cccDNA难以被完全清除，这为CHB的临床治愈带来了挑战。基于近年来发展起来的蛋白质结构预测技术，这里我们比较分析了HIV和HBV逆转录酶可能的结构差异，并讨论这些差异是否与NAs药物的抗HIV和抗HBV治疗作用的差异相关。我们预期HBV聚合酶（Polymerase,P）的蛋白结构将被解析。届时，针对P蛋白逆转录酶结构域所设计和优化的更强效、更特异的新型NAs类药物，也许将给临床抗病毒治疗策略带来改变，显著改善慢性乙肝患者的预后。

核苷（酸）类似物（nucleos(t)ide analogues, NAs）是指对天然核苷或核苷酸进行化学修饰等改造后得到的一类可与细胞内源的核苷（酸）竞争性掺入抑制病毒DNA聚合酶、逆转录酶或RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）的化合物。通过阻断病毒DNA或RNA链的延长和子代病毒基因组的合成，干扰或抑制病毒或宿主细胞DNA或RNA复制。

最早发现的具有药用价值的NAs可以追溯到20世纪50年代从海洋生物海绵中提取出的两种化合物，海绵阿糖核苷（胸腺嘧啶核苷）和海绵阿糖尿苷碘苷（尿嘧啶核苷） [1-2] 。这两种化合物的发现为后来抗病毒药物阿糖腺苷以及抗癌药物阿糖胞苷的研发奠定了基础 [3] 。1963年，一种碘化的胸腺嘧啶核苷类似物——碘苷，成为了世界上首个获得FDA批准用于单纯疱疹型角膜炎临床治疗的抗病毒药物，由此开启了抗病毒药物以及NAs蓬勃研发的新纪元。除了可用于抗疱疹病毒感染外，NAs还可用于人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、巨细胞病毒（CMV）及水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染的治疗。1987年上市的NAs药物齐多夫定是世界上首个获得FDA批准生产的抗HIV药物，在目前治疗艾滋病应用的鸡尾酒疗法中，齐多夫定依然是重要的组成部分。除了齐多夫定外，用于抗HIV感染的NAs还有替诺福韦、司他夫定、阿巴卡韦、拉米夫定和去羟基苷等。在新型冠状病毒感染治疗相关的临床研究中，也应用到了NAs [4] 。

临床上，人们最早在接受靶向HIV逆转录酶的NAs治疗的HIV和HBV共感染患者中观察到了HBV DNA水平的下降。考虑到HIV和HBV病毒基因组的复制有着类似的、由各自病毒逆转录酶介导的逆转录过程，NAs开始逐渐用于HBV的抗病毒治疗中。该类药物通过抑制病毒复制显著减缓了慢性HBV感染所致肝组织的炎症反应、减缓了疾病进展、减少了包括肝硬化、失代偿肝硬化等终末期肝病的发生。机制上，NAs与细胞内dNTP竞争性结合HBV P蛋白，掺入到新合成负链DNA的3’末端，由于掺入NA的3’-OH被替换为其他基团使DNA链无法继续延伸，从而抑制pgRNA逆转录成为rcDNA [5] 。目前，临床上应用最为广泛的恩替卡韦（entecavir, ETV）、富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate, TDF）和富马酸丙酚替诺福韦酯（tenofovir alafenamide fumarate, TAF）被各大主流指南推荐为 “强效”的一线抗病毒药物 [6] 。然而事实上，所谓的强效是与既往的拉米夫定（Lamivudine，又称3-TC）等的抗病毒药效相比而言。而实际上，这些新的一线药物无一能有效清除肝细胞内以共价闭合环状DNA（covalently closed circularDNA, cccDNA）形式存在的HBV基因组，停药后往往会发生病毒学反弹和疾病复发，以至于接受NAs治疗的患者不得不长期甚至终生用药 [7-8] 。除此之外，无论是在临床试验还是临床应用中，随着检测灵敏度的提高，有接近20%的患者会出现低病毒血症（low level viremia, LLV） [9-10] 。且大量的临床研究已经证实了LLV与疾病进展和不良预后密切相关。例如，Sun等人对239例CHB患者进行的前瞻性研究发现LLV会促进肝纤维化进展 [11] 。此外，一项来自我国香港的队列研究也提示，NAs治疗下 HBV DNA 和 pgRNA 低值阳性与患者肝细胞癌发生有关 [12] 。

我们推测，LLV的发生与NAs竞争性抑制HBV DNA复制作用的局限性有关。首先，胞内大量dNTP的存在（每种dNTP含量约为10nmol/10 ⁸ 个细胞 [13] ），使得NAs不能100%地抑制子代rcDNA合成 [14] 。加之cccDNA池在感染初期就已经形成且相对稳定，也使得NAs阻断内补充途径来耗竭cccDNA的作用非常有限，致使部分患者发生LLV [5] 。此外，LLV的发生也与患者较弱的抗HBV特异性细胞免疫有关。由于感染肝细胞不能得到有效清除，难以诱发残存肝细胞的活跃性代偿增殖和伴随发生的cccDNA池的有效稀释 [15] 。而较高水平的活跃转录的cccDNA池则有利于LLV的发生。由此可见，现有的NAs药物作用有限，其“强效”仅是相对于既往的HBV抗病毒药物而言，未来亟需研发有更强抗病毒作用的NAs药物。

HBV和HIV都存在病毒逆转录活性蛋白介导的逆转录合成病毒DNA的过程，其中HBV依靠P蛋白将cccDNA转录出的pgRNA逆转录为rcDNA形成子代病毒基因组；而HIV依靠pol基因编码的逆转录酶将基因组RNA逆转录为双链DNA，并整合入宿主染色体DNA形成前病毒。NAs药物的作用机制正是通过与胞内dNTP竞争性地同逆转录酶手形结构域结合 [16] ，进而抑制病毒逆转录的过程。但考虑到NAs最开始在抗HIV中运用，其对HBV治疗的有效性和肝细胞靶向性可能存在差异。粗略观察TDF及TAF治疗HIV感染和慢性HBV感染后的病毒抑制效率，二者对HIV病毒RNA复制的抑制能力似乎更强，而对HBeAg阳性慢性HBV感染患者的HBV DNA抑制能力则较弱 [17-19] 。Painter GR等人分析了不同细胞中替诺福韦抗HIV与HBV的半最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect, EC ₅₀ ）。结果也提示，替诺福韦对HIV病毒的抑制作用或强于其对HBV的抑制作用 [20] 。但需要注意的是，HIV和HBV药效评价方法不同，HIV通过细胞毒性评价EC 50 而HBV则是通过检测细胞内HBV DNA来评价EC ₅₀ 。因此，这里的比较可能只是提示作用，并不能得出准确的结论（表1）。

考 虑到 HBV和HIV感染患者NAs治疗的疗效差异可能与二者逆转录酶结构相关，接下来我们对比分析了HBV P蛋白和HIV p66在 氨基酸序列和三维结构上的异同。首先从氨基酸序列上看， HBV P蛋白（genetype B GenBank：AB554017）与HIV p66（NCBI Reference Sequence: NP_705927.1）的氨基酸序列相似性仅为25.49%，二者活性区域的序列相似性为26.14% ，而如果考虑二者之间蛋白序列的全同性（identity）则更低至仅有大约1 6% （图1），这提示HIV P66和HBV P蛋白尽管可能有一定的相似性，但其结构在细节上的区别可能会是比较大的。将既往文献中预测的 HBV P蛋白三维结构 [21] 与已 实验测定的 HIV p66三维结构 [22] 进行叠合比较，全分子和活性区域的均方根偏差（ RMSD）值分别为4.707 Å和2.183 Å，提示 两种聚合酶总体结构上差异较大，虽在逆转录酶的活性区域存在明显的结构相似性，但细节上的差异仍较大，这为 NAs类药物可同时表现出抗HIV和抗HBV活性 ，但活性高低不同提供了结构基础（图 2 A、B）。 由于两者在氨基酸序列上相似性较差，理论上会带来两者间理化性质的差异，可能也参与导致了 NAs在抗HBV和抗HIV治疗中的疗效不同。

综上所述，尽管HBV P蛋白和HIV p66在RT结构域上有类似的保守结构，这为ETV、TDF和TAF所展现出的对HBV和HIV病毒基因组的逆转录复制的抑制提供了结构基础。但是两者在结构上仍然有很大差异，这种差异可能是导致了现有的NAs类药物对HBV治疗疗效的差强人意的重要因素。因此，针对HBV P蛋白RT结构域改良的新型NAs药物，可能是未来HBV抗病毒治疗药物研发的重要方向之一。

由于HIV和HBV都存在逆转录复制的过程，最初在HIV治疗中使用的部分NAs药物已被用于HBV的抗病毒治疗中并发挥着不错的疗效，比如TDF等 [5] 。但值得注意的是，目前使用的NAs药物在HBV治疗中仍存在局限性，无法彻底清除HBV感染致使停药后仍有较高的病毒反弹和疾病复发风险，并因竞争抑制不完全常有一定比例的低病毒血症的发生。这提示我们，现在主流的NAs药物仍不是真正的“强效”抗HBV病毒药物。考虑到同一种NAs药物在HIV和HBV的抗病毒治疗中的疗效差异，未来应针对HBV P蛋白结构对已有的NAs进行优化，以进一步提高其对HBV DNA复制的抑制效果，减少低病毒血症发生和改善患者预后，为实现患者的功能性治愈提供可能。

需要指出的是，本文对NAs在HIV和HBV治疗中有效性的比较存在一定的局限性。一方面，HIV和HBV药效评价采用的检测体系不同。HIV通过细胞毒性评价EC ₅₀ ，而HBV通过检测细胞内HBV DNA来评价EC ₅₀ ，未来需要找到更一致的评价方式来反映药物的有效性（比如直接或间接比较逆转录酶活性的抑制水平）。此外，二者所用细胞种类和培养代数不同，会导致细胞膜NAs转运体表达量和NAs排出细胞的代谢速率不同，也会引起二者疗效差异。另一方面，替诺福韦等进入细胞后需要磷酸化变为二磷酸的活性形式，如果能直接比较活性形式的EC ₅₀ 将能更好地反应NAs在HIV和HBV治疗中的疗效差异。最后，HIV是RNA病毒，逆转录过程发生在病毒感染复制周期的早期，即病毒RNA逆转录为双链DNA，在其DNA整合入人类基因组后才能大量复制，是HIV生命周期中的限速步骤。而HBV是DNA病毒， 其逆转录发生在pgRNA形成子代病毒基因组DNA的过程中。此时cccDNA可转录出大量的pgRNA，在数量上远远多于HIV有限进入细胞的RNA基因组。同时，由于HBV RNA病毒样颗粒也可能参与病毒的感染复制 [23] ，NAs将更难于完全阻断HBV的感染复制。因此，除了药物本身所带来的疗效差异外，相同剂量的NAs 阻滞HIV复制的效果也可能强于HBV。

另外特别需要注意的是，由于HBV P蛋白尚未见到实验测定的三维结构报道，本文中主要通过其理论预测结构与实验测定的HIV p 66 蛋白结构进行比较。由于结构预测的可靠性问题，这一方法只能起到提示作用。对HBV P蛋白所进行的结构预测的正确性和准确性难以判定，后续需要通过大量的功能实验来验证所预测的结构，或者通过实验手段实际测定其结构。

由于 P蛋白 的真实三维结构至今仍是未知的，限制了新一代针对 HBV的NAs药物的研发。已知对HBV P蛋白结构解析的挑战之一是其本身的 折叠困难性，以至于往往需与分子伴侣相互作用才能保持其溶解度和构象活性 [24] 。因此，大多数研究常用的蛋白表达系统很难产出具有可溶性与活性形式的P蛋白。但随着对蛋白质结构解析的经验积累和对共性认识的提高，人们已经预测了HBV P蛋白不同结构域的结构，并揭示了P蛋白有在进化中保守的折叠结构 [17] 。特别是近年来，随着蛋白质结构解析技术的发展，越来越多的未知蛋白的结构被解析。与此同时，基于人工智能的蛋白质3D结构预测也发展迅速，AlphaFold2 [25] 、