背景介绍
地中海贫血症是由于珠蛋白基因突变或缺失而引起，导致一种或多种珠蛋白表达降低或结构异常。珠蛋白链表达的这种不平衡破坏了血红蛋白四聚体的聚合，引起红细胞脆化和溶血性贫血。地中海贫血患者主要分布在地中海沿岸地区，非洲，中东，印度和东南亚。其他研究显示，广西，广东和海南等中国南部省份的地中海贫血患病率异常高。我们最近的调查发现云南省也是地中海贫血患病率高的省份。大多数人携带四个α-珠蛋白基因和两个β-珠蛋白基因。 两个β-球蛋白和两个α-球蛋白为铁离子与四个血红素分子提供支架形成血红蛋白。由一个等位基因的缺失或功能障碍导致的α-地中海贫血携带者也被称为“静止型”，因为血液学特征通常是完全正常的。当两个等位基因发生缺失或功能异常时，无论是反式还是顺式，存在轻微的无症状性小细胞性贫血（轻型）。三个α-珠蛋白等位基因的失活，“HbH病”具有从轻度到重度的可变表现。缺乏4个α基因是致命的：除非子宫内接受输血，否则儿童出生时表现致命的水肿。
由一个等位基因的缺失或功能异常导致的β地中海贫血携带者也被称为轻型的，具有轻微的临床症状。缺少两个β-珠蛋白等位基因，重型β-地中海贫血，通常表现为需要终身输血的严重贫血，然而，有时候，表型是可变的，有可能是轻微的。因此，在世界上α地中海贫血症或β地中海贫血症流行的地区进行有效的婚前筛查很重要。
新一代测序（NGS）可以同时产生大量的基因组数据，揭示人类的遗传变异并评估潜在的健康风险。 NGS被广泛应用于地中海贫血患者的无创性产前诊断和新型突变检测。本研究利用NGS进行大规模人群筛查，以评估云南傣族地区的地中海贫血携带者频率，探索其在预防严重地中海贫血和降低儿科死亡率方面的潜在用途。
材料与方法
入组人群
共有来自德宏（瑞丽，芒市，梁河，印江，龙川）和西双版纳（勐海，蒙古，蒙哲）地区的中国云南省德宏婚前或新婚少数民族1451人参加了筛查。
使用血液学表型分析的传统携带者筛选
使用传统的血液学方法筛选所有样品。 这包括每个样本的常规血液检查和血红蛋白电泳。 如果对以下至少一项获得阳性结果：（i）低细胞色素的红细胞指标，包括平均红细胞容积（MCV）≤80fl和/或平均红细胞血红蛋白（MCH）≤27pg，和（ii）HbA2≤2.5％（疑似α地中海贫血携带者的异常血红蛋白浓度）或HbA2≥3.5％（疑似β地中海贫血携带者的异常血红蛋白浓度），胎儿血红蛋白（HbF）在某些情况下≥2.0％。如果MCV或MCH先阳性，然后HbA2阳性，则血液学筛查定义为阳性。
PCR扩增，合并，文库构建和二代测序
我们设计了6对引物，对应于HBA1，HBA2，HBB-1和HBB-2四个基因突变和两个缺失突变（HBA-Q和HBB-Q）进行PCR扩增。扩增子原则上应检测HbVar数据库中最常见的致病点突变和拷贝数变异（CNV）。将四点突变PCR扩增子合并到一个等体积的离心管中，并将两个CNV扩增子合并到第二个管中。我们需要≥5μg（合并点突变）和≥1μg（合并CNV）扩增子。我们采用Illumina Hiseq测序文库制备方案进行文库构建，使用Illumina HiSeq2000机器使用双端测序（PE100），我们每个基因组文库总共生成1.5 Gbp。
数据分析
基于重测序策略，开发了一个以检测Hb基因点突变和缺失为重点的生物信息学过程。我们使用不同策略处理点突变和InDel与CNV。基于目标基因数据与内参基因的对比，我们使用HBA1-Q，HBA2-Q，HBB-Q和内对照基因的reads深度统计来估计样品与正常对照之间的相对比率，这被用来计算每个样品的绝对拷贝数。
结果
NGS分析结果
从951个样本中共鉴定出471个地中海贫血突变携带者
，具体见图1.
从结果来看，与西双版纳州人群相比，德宏人群携带复合型α地中海贫血和β地中海贫血携带者的比率更高。我们确定了21种不同类型的α-地中海贫血突变。超过44.5％（129/290）的携带者为基因缺失，其中-α
3.7
/αα最常见，--
SEA
/αα为第二常见。我们在筛选的队列中鉴定了10个β-珠蛋白基因突变。 超过63.6％（63/99）的样本携带密码子26基因突变。
α-珠蛋白和β-珠蛋白基因突变和频率的排名
本研究检测到12种α-珠蛋白基因突变。其中，最常见的两种基因突变是-α
3.7
和--
SEA
，占所有突变的80.0％（335/419）。α
CS
α，α
WS
α和-α
4.2
紧随其后，占15.0％（63/419）的α-珠蛋白突变（见表1）。在本研究中检测到11种类型的β-珠蛋白基因突变。 最常见的三种是密码子26，密码子41-42和密码子17，占87.9％（167/190）。
传统血液学和NGS筛查方法的比较
检出率差异
尽管从951例样本中根据红细胞指标筛查出452例低细胞色素（
阳性率为47.5％
），但在结合红细胞指标和血红蛋白电泳后仅剩77例疑似α地中海贫血携带者，传统的筛查方法检出率仅为16.4％（61/372）; 传统方法错过了83.6％（311/372）的α地中海贫血携带者。同样，基于红细胞指标和血红蛋白电泳结合的β-地中海贫血基因突变检出率为72.9％（132/181）。相比之下，NGS预测出更高的携带者频率。此外，MCV + MCH和HbA2联合检测策略导致α-和β-地中海贫血合并携带者的低敏感性和高漏诊率。
讨论
在本研究中，我们发现用NGS方法筛查的傣族人群中地中海贫血携带率高达49.5％，高于以前使用血液学筛查方法报道的数据。这也是第一个精确揭示中国傣族成人队列中携带地中海贫血的研究。
