辨清敌我，统一战线——确定基因上下游关系（二）

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假设基因A具有正调控作用，基因B具有负调控作用。首先分别创制基因A和基因B的单突变体，比较A突变体与野生型的表型差异，确定基因A的正调控作用；比较B突变体与野生型的表型差异，确定基因B的负调控作用。然后创制双突变体，比较双突变体A/B与单突变体A和B的表型差异，分析基因A和B之间的调控关系：

如果A突变体的表型是某些特定性状缺失或减弱，而双突变体A/B的表型与A突变体相似，说明基因B的突变不能恢复基因A突变导致的性状缺失或减弱，这种情况表明基因B在基因A的上游。如案例1所示。

如果A突变体的表型是某些特定性状缺失或减弱，而双突变体A/B的表型与B突变体相似，说明基因B的突变能够恢复基因A突变导致的性状缺失或减弱，这种情况表明基因A在基因B的上游。如案例2所示。

案例 1

2024年7月，中国农业大学张小兰课题组在 The Plant Cell 杂志上发表了一篇题为“The AGAMOUS-LIKE 16-GENERAL REGULATORY FACTOR 1 module regulates axillary bud outgrowth via catabolism of abscisic acid in cucumber”的研究论文。作者发现黄瓜MADS-box转录因子 AGAMOUS-LIKE 16 （ CsAGL16 ）正调控黄瓜侧枝伸长 ， CsAGL16 突变后导致侧枝减少，而过表达则促进了侧枝伸长。此外，作者还发现黄瓜General Regulatory Factor 1（CsGRF1）与CsAGL16在蛋白水平上相互作用，并抑制了CsAGL16对 CsCYP707A4 的转录激活。 CsGRF1 负调控黄瓜侧枝伸长 ， CsGRF1 突变后促进了腋芽伸长并降低了腋芽中的ABA水平。为了探究 CsGRF1 和 CsAGL16 的遗传关系，作者创制了 Csagl16 Csgrf1 双突变体，发现 Csagl16 Csgrf1 双突变体表现出与 Csagl16 单突变体相似的分枝表型 （图1A、B），与WI1983M和 Csgrf1 相比， Csagl16 单突变体 和 Csagl16 Csgrf1 双突变体每株的平均侧枝数量和分枝总长度均显著减少（图1C、D）。这些结果表明在黄瓜侧枝发育过程中， CsGRF1 在 CsAGL16 上游起作用。

图1 Csagl16 Csgrf1 双突变体的表型分析(Chen et al., 2024)。（A）WI1983M、 Csagl16 、 Csgrf1 、 Csagl16 Csgrf1 植株的表型；（B）WI1983M、 Csagl16 、 Csgrf1 、 Csagl16 Csgrf1 植株的侧枝位置和长度。每列表示一株黄瓜植株。每层代表黄瓜植株中的一个节点。绿色方块：无芽生长；黄色方块：芽长≥4cm；棕色方块：侧枝长≥50cm；（C）WI1983M、 Csagl16 、 Csgrf1 、 Csagl16 Csgrf1 植株的单株平均分枝数；（D）WI1983M、 Csagl16 、 Csgrf1 、 Csagl16 Csgrf1 植株的单株侧枝总长度；（E） CsCYP70A4 在WI1983M、 Csagl16 、 Csgrf1 、 Csagl16 Csgrf1 植株腋芽中的相对表达量。

案例 2

2022年6月，中科院分子植物科学卓越创新中心林鸿宣课题组与上海交通大学林尤舜课题组联合在 Science 杂志上发表了一篇题为“A genetic module at one locus in rice protects chloroplasts to enhance thermotolerance”的研究论文。作者定位克隆到一个控制水稻高温抗性的新QTL位点TT3。非洲栽培稻（CG14）来源的TT3相较于亚洲栽培稻（WYJ）来源的TT3具有更强的高温抗性。进一步研究发现，TT3位点中存在两个拮抗调控水稻高温抗性的QTL基因 TT3.1 和 TT3.2 ，其中 TT3.1 正向调控高温抗性 ，而 TT3.2 负向调控高温抗性 （图2）。将 tt3.1 突变体、 tt3.2 突变体杂交后得到 tt3.1 tt3.2 双突变体，检测 tt3.1 tt3.2 双突变体在正常和42℃高温条件下生长7天后的表型和存活率，发现 tt3.1 tt3.2 双突变体的表型与 tt3.2 突变体表型相似 （图3），说明 TT3.1 在 TT3.2 的上游起作用。

图2 TT3.1 与 TT3.2 过表达或敲除株系的耐热表型分析(Zhang et al., 2022)。（a-d） tt3.1 突变体（a）、 tt3.2 突变体（b）、过表达 TT3.1 ^WYJ （c）和过表达 TT3.1 ^CG14 （d）转基因水稻植株在正常条件下和42℃热胁迫7天后的表型。

图3 tt3.1 tt3.2 双突变体耐热表型分析(Zhang et al., 2022)。 （a） tt3.1 tt3.2 双突变体在正常条件下和42℃热胁迫7天后的表型；（b） tt3.1 tt3.2 双突变体在正常条件下和42℃热胁迫7天后的存活率。

假设基因A具有负调控作用，基因B具有正调控作用。首先分别创制基因A和基因B的过表达株系，比较基因A过表达株系（OE-A）与野生型（WT）的表型差异，以确定基因A的负调控作用；比较基因B过表达株系（OE-B）与野生型（WT）的表型差异，以确定基因B的正调控作用。然后创制双过表达株系，比较双过表达株系（OE-AB）与单基因过表达株系（OE-A和OE-B）的表型差异，分析基因A和基因B之间的调控关系：

如果基因A过表达株系（OE-A）的表型是某些特定性状缺失或减弱，而双过表达株系（OE-AB）表型恢复至野生型或接近野生型表型，或者双过表达株系（OE-AB）表型与B过表达株系一致，说明基因B的过表达能够恢复基因A过表达引起的表型缺失或减弱。这种情况表明，基因A在基因B的上游。如案例3、案例4所示。

如果基因A过表达株系（OE-A）的表型是某些特定性状缺失或减弱，而双过表达株系（OE-AB）表型与A过表达株系一致，说明基因B的过表达不能恢复基因A过表达引起的表型缺失或减弱。这种情况表明，基因B在基因A的上游。但是这种情况小远未找到相应的文献案例，如果大家有相关的文献，记得分享给小远噢。

案例 3

2023年4月，华中农业大学欧阳波课题组在 Horticulture Research 杂志上发表了一篇题为“SlZF3 regulates tomato plant height by directly repressing SlGA20ox4 in gibberellic acid biosynthesis pathway”的研究论文。作者发现 SlZF3 负调控番茄株高 ，过表达 SlZF3 可导致番茄矮化。随后作者利用Y1H、Dual-LUC、ChIP-qPCR和EMSA实验证明SlZF3可直接结合到 SlGA20ox4 的启动子上（图4a-e）。为了进一步探究 SlZF3 和 SlGA20ox4 的遗传关系，作者在 SlZF3 过表达株系的背景上进一步过表达 SlGA20ox4 ，获得 SlZF3 SlGA20ox4 双过表达株系，发现 SlZF3 SlGA20ox4 双过表达株系的 株高 与野生型相似 ， 说明 SlZF3 过表达对株高的抑制作用在 SlGA20ox4 过表达背景中得到缓解 （图4f-h），从遗传关系上进一步揭示 SlZF3 在 SlGA20ox4 的上游发挥作用来调控株高。

案例 4

2017年9月，中国科学院西双版纳热带植物园余迪求课题组在 Molecular Plant 杂志上发表了一篇题为“Arabidopsis WRKY45 interacts with the DELLA protein RGL1 to positively regulate age-triggered leaf senescence”的研究论文。作者发现 WRKY45 是植物衰老的正调控因子 ， WRKY45 基因突变能延缓植物衰老进程，而其过表达则显著促进植物衰老进程。进一步研究发现WRKY45能与RGL1蛋白在细胞核内相互作用形成复合物共同调控植物衰老进程。同时作者 分析发现 RGL1 是植物衰老的负调控因子 ， RGL1 过表达能显著延缓植物衰老。为了研究 WRKY45 和 RGL1 的遗传关系，作者将 35S:RGL1 与 35S:WRKY45-15 杂交得到 35S:WRKY45-15/35S:RGL1 双过表达株系，发现与 35S:RGL1 相比， 35S: WRKY45-15/35S: RGL1 双过表达株系表现出早期衰老表型，说明 WRKY45 的过表达能够使 RGL1 过表达延缓植物衰老的表型得到抑制 （图5）。这些结果表明， RGL1 在 WRKY45 的上游发挥作用从而调控植物衰老。

图5 RGL1 在 WRKY45 的上游发挥作用从而调控植物衰老(Chen et al., 2017)。（A）6周龄的Col-0、 35S:WRKY45-15 、 35S:WRKY45-15 /35S :RGL1 和 35S :RGL1 株系的衰老表型；（B）6周龄的Col-0、 35S:WRKY45-15 、 35S:WRKY45-15 /35S :RGL1 和 35S :RGL1 株系在指定叶片年龄的相对叶绿素含量；（C-I）实时荧光定量PCR分析6周龄的Col-0、 35S:WRKY45-15 、 35S:WRKY45-15 /35S :RGL1 和 35S :RGL1 株系中衰老标记基因的转录水平。

首先分别创制基因A和基因B的单突变体，比较A突变体与野生型的表型差异，确定基因A的正调控作用；比较B突变体与野生型的表型差异，确定基因B的正调控作用。然后创制过表达/突变体杂交材料，比较过表达/突变体杂交材料与野生型、单突变体A或B的表型差异，分析基因A和B之间的调控关系：

如果基因A突变体表现出某些特定性状缺失或减弱，而突变体A/过表达B杂交材料表型恢复至野生型或接近野生型表型，说明基因B的过表达能够补偿基因A突变引起的表型缺失或减弱。这种情况表明，基因A在基因B的上游。如案例5所示。

如果基因A突变体表现出某些特定性状缺失或减弱，而突变体A/过表达B杂交材料表型与基因A突变体表型相似，说明基因B的过表达不能补偿基因A突变引起的表型缺失或减弱。这种情况表明，基因B在基因A的上游。如案例6所示。

案例 5

2021年1月，四川大学刘建全课题组在 New Phytologist 杂志上发表了一篇题为“WRKY33 interacts with WRKY12 protein to up-regulate RAP2.2 during submergence induced hypoxia response in Arabidopsis thaliana”的研究论文，揭示了WRKY33/WRKY12-RAP2.2分子模块调控拟南芥水淹低氧适应的新机制。作者发现 WRKY33 、 WRKY12 和 RAP2.2 均正向调控水淹环境中的缺氧反应 ，与野生型Col相比，三个基因的过表达拟南芥材料均呈现出明显的抗水淹胁迫表型，例如存活率增加，叶片损伤较小，过氧化物积累减少，MDA积累减少。为了进一步研究 WRKY33 、 WRKY12 和 RAP2.2 在水淹低氧途径中的遗传关系，作者通过遗传杂交，获得 wrky12 RAP2.2-OE 和 wrky33 RAP2.2-OE 拟南芥材料并进行水淹表型分析，发现 过表达 RAP2.2 能分别恢复 wrky12 和 wrky33 突变体的水淹胁迫表型 （图6）。表明 WRKY12 和 WRKY33 转录因子可能通过 RAP2.2 正向调控缺氧应激反应， WRKY33 和 WRKY12 可能在缺氧反应途径中位于 RAP2.2 的上游。

图6 WRKY12 、 WRKY33 和 RAP2.2 之间的遗传关系分析(Tang et al., 2021)。（a-c）4周龄的拟南芥野生型（WT）、 wrky12 、 wrky33 、 RAP2.2-OE 、 wrky12 RAP2.2-OE 和 wrky33 RAP2.2-OE 植物的表型：（a）淹水前、（b）淹水48小时后、（c）恢复4天后；（d）相应植物的示意图；（e）植株的存活率；（f）恢复4天后植株的DW : FW比率。FW为初始鲜重，DW为干重；WT的DW : FW比率设为1。

案例 6

2024年7月，中国农业大学胡兆荣课题组在 The Plant Cell 杂志上发表了一篇题为“Methyltransferase TaSAMT1 mediates wheat freezing tolerance by integrating brassinosteroid and salicylic acid signaling”的研究论文。作者发现 TaSAMT1 可能通过影响 MeSA 合成正向调控小麦耐冷性 ，与野生型相比， TaSAMT1 -OE株系耐冷性显著提升，而敲除株系耐冷性则显著降低。随后作者筛选鉴定到 TaSAMT1 基因的上游调控蛋白TaBZR1，并通过超表达株系和突变体表型鉴定发现 TaBZR1 能够正向调控小麦耐冷性 。为了进一步确定 TaSAMT1 和 TaBZR1 在小麦耐冷性调控中的遗传关系，作者 将 TaBZR1 过表达系（ox-2）与 Tasamt1 突变体（ KO#3 ）杂交 ，发现 TaBZR1 ox-2/ Tasamt1 KO#3 株系 与 Tasamt1 突变体表 型相似，均表现 出 较低的耐冷性 ，说明 TaBZR1 的过表达不能恢复 TaSAMT1 突变导致的耐冷性降低 （图7），表明 TaBZR1 在 TaSAMT1 的上游起作用并参与小麦耐冷性调控。

图7 TaSAMT 在 TaBZR1 介导的BR途径中参与耐冷性调控是必需的(Chu et al., 2024)。（A）在冷胁迫处理下，Fielder、KN199、 TaBZR1 ox-2、 Tasamt1 （ KO#3 ）、 TaBZR1 ox-2/Fielder和 TaBZR1 ox-2/ Tasamt1 KO#3 株系的表型；（B）冷胁迫处理后各基因型株系的存活率；（C）在对照和冷胁迫处理下各基因型株系的电解质渗漏情况。

首先分别创制基因A和基因B的单突变体，比较A突变体与野生型的表型差异，确定基因A的负调控作用；比较B突变体与野生型的表型差异，确定基因B的负调控作用。然后创制过表达/突变体杂交材料，比较过表达/突变体杂交材料与野生型、A过表达或B过表达材料的表型差异，分析基因A和B之间的调控关系：

如果基因A过表达表现出某些特定性状缺失或减弱，而过表达A/突变体B杂交材料表型与A过表达株系表型相似，说明基因B的敲除不能恢复基因A过表达导致的表型缺失或减弱。这种情况表明，基因B在基因A的上游。如案例7所示。

如果基因A过表达表现出某些特定性状缺失或减弱，而过表达A/突变体B杂交材料表型恢复至野生型或接近野生型表型，说明基因B的敲除能够恢复基因A过表达导致的表型缺失或减弱。这种情况表明，基因A在基因B的上游。如案例8所示。

案例 7

2024年1月， 南京农业大学徐国华课题组、顾冕课题组和上海市农业生物基因中心严明课题组联合在 The Plant Cell 杂志上发表了一篇题为“The transcription factor MYB110 regulates plant height, lodging resistance, and grain yield in rice”的研究论文。作者发现 MYB110 是株高的负调控因子 ， OsMYB110 突变后使水稻株高显著增加。 PHR2 也是株高的负调控因子 ， OsPHR2 过表达植株的株高均低于WT植株。此外，作者发现OsPHR2可直接与 MYB110 启动子中的P1BS基序结合。为了研究 OsPHR2 和 MYB110 之间潜在的遗传相互作用，作者进行了 PHR2-Ox 株系和 myb110 突变体之间的杂交，发现 MYB110 在 PHR2-Ox 背景中的突变使株高恢复到与 myb110 突变体相当的水平 （图8A、B）。相比之下， MYB110-Ox 背景中 OsPHR2 的突变并不能挽救 MYB110-Ox 植物的迟缓生长 （图8C、D）。同时， myb110 phr2 双突变体的高度与 myb110 植株相似（图8E、F）。这些结果表明， OsPHR2 在 MYB110 上游发挥作用调节植物株高。

图8 PHR2 在遗传上作用于 MYB110 上游并负调控植株高度(Wang et al., 2024)。（A、B）野生型（WT）、 myb110 、 PHR2-Ox 及其杂交材料植株表型（A）和植株高度（B）；（C、D）野生型（WT）、 MYB110-Ox 、 phr2 及其杂交材料植株表型（C）和植株高度（D）；（E、F）野生型（WT）、 myb110 、 phr2 及其杂交材料植株表型（E）和植株高度（F）。

案例 8

2024年3月，中山大学陈月琴/练剑平课题组和广东省农科院于洋课题组联合在 The Plant Cell 杂志上发表了一篇题为“A transthyretin-like protein acts downstream of miR397 and LACCASE to regulate grain yield in rice”的研究论文。在前期研究中，作者发现漆酶基因 OsLAC 负调控植株高度和籽粒大小 ，但其作用机制尚不清楚(Zhang et al., 2013)。在该研究中，作者对 OsLAC 进行了生化和遗传学分析，发现OsTTL蛋白可与OsLAC相互作用。同时发现 OsTTL 负调控植株高度、籽粒大小和产量 ，在水稻中过表达 OsTTL 导致植株呈现株型矮小、叶片直立、籽粒变小和产量降低等表型，而敲除 OsTTL 基因则导致植株株型变大、籽粒增大和产量提高。 为了进一步研究 OsLAC 和 OsTTL 之间潜在的遗传关系， 作者将 Osttl 突变体 与 OsLAC 过表达（OXLAC× Osttl ）或敲除（ Oslac × Osttl ）植株进行杂交，发现OXLAC× Osttl 株系的表型与野生型相似，说明 OsTTL 的 敲除恢复 了 OXLAC 植 株 的发育缺陷（ OXLAC × Osttl ） ，包括植物结构、穗分枝和籽粒大小的缺陷。 Oslac × Osttl 双突变体的产量相关性状与 Osttl 植株相似（图9）。这些结果表明 OsLAC 在 OsTTL 上游起作用以调节植株高度和籽粒产量。

图9 OsLAC 和 OsTTL 之间的遗传关系分析(Yu et al., 2024)。（A-C）比较野生型（WT）、 OsLAC 过表达（OXLAC）、 Osttl 、 Oslac 、在 Osttl 背景下过表达 OsLAC （OXLAC× Osttl ）和 OsLAC 与 OsTTL 双突变体（ Oslac × Osttl ）的植株表型（A）、穗结构（B）和籽粒大小（C）；（D-F）对野生型（WT）和 OsLAC/OsTTL 相关植株分枝数（D）、每个主穗的籽粒数（E）和千粒重（F）的分析。