​​用于Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗生产的无酚红M199培养基贮存效期验证

目的 验证无酚红M199培养基的贮存效期，同时探索无酚红M199效期对无酚红Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated Sabin strain poliovirus vaccine，sIPV）关键质量属性的影响。

方法 对贮存0、6、12、18、24、30、36及42个月的3批次无酚红M199干粉培养基进行外观、澄清度、pH、干燥失重、细菌内毒素、微生物限度等物理化学性质及微生物性质长期监测；检测用贮存36个月并检定合格的无酚红M199制备的sIPV成品关键质量属性；将近效期和远效期无酚红M199制备的各3批sIPV分别贮存于37 ℃和25 ℃进行稳定性监测，检测D抗原含量，评价其稳定性；用2组sIPV免疫大鼠，检测大鼠血清抗体效价，评价其免疫原性。

结果 无酚红M199干粉培养基于2~8 ℃贮存42个月后的外观、澄清度、pH、干燥失重、细菌内毒素、微生物限度等均合格；用贮存36个月无酚红M199所制备sIPV成品的pH、D抗原、蛋白含量、Vero细胞DNA残留量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞蛋白残留量、游离甲醛含量等各项检定结果均符合中国药典2020年版三部和企业标准要求；用贮存36个月无酚红M199制备的sIPV效价合格、稳定性良好且与远效期无酚红sIPV免疫原性趋势一致，效力（ t = - 0.15~2.17， P ＞0.05）和诱导中和抗体水平（ t = - 1.46~2.02， P ＞0.05）差异均无统计学意义。

结论 用贮存至36个月的无酚红M199制备的sIPV成品稳定性较好，近效期和远效期无酚红M199制备的sIPV产品质量属性、免疫原性及稳定性趋势一致，且对产品质量无影响，无酚红培养基的效期初步可定为36个月。

无酚红M199培养基（Rf1：Gibco批号2299574、Rf2：Gibco批号2299576、Rf3：Gibco批号2286073）购自美国Gibco公司；sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量测定试剂盒，Vero细胞残余蛋白检测试剂盒，Ⅱ型脊灰疫苗病毒滴定质控品来自北京生物制品研究所有限责任公司（北京公司）；细菌内毒素工作标准品购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；Vero细胞DNA工作参考品、Hep-2细胞、蛋白含量测定国家标准品（非人用）及Ⅰ、Ⅲ型脊灰疫苗病毒滴定国家参考品购自中国食品药品检定研究院。

无特定病原体级Wistar大鼠，410只，雌雄各半，体质量170~200 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物饲养许可证号：SYXK（京）2020-0031。

将Rf1、Rf2、Rf3无酚红M199干粉培养基贮存于2~8 ℃，于0、6、12、18、24、30、36及42个月时取样，按照中国药典2020年版三部（药典三部）要求以及培养基质量企业标准（企标）检定，检测外观、澄清度、pH、干燥失重、细菌内毒素、微生物限度等项目。

sIPV单价原液由北京公司经病毒培养、收获、浓缩纯化及灭活等工艺制备。分别将远效期和近效期（贮存36个月并检定合格）的Rf1、Rf2、Rf3无酚红M199干粉培养基按比例溶解配制成无酚红M199溶液，取各型别sIPV单价原液超滤离心（1 958× g 离心5 min），分别加入Rf1、Rf2、Rf3无酚红M199溶液，反复3次，置换成无酚红sIPV单价原液，然后按比例配制成无酚红sIPV成品。远效期无酚红制备sIPV批号为M1—M3，近效期批号为A1—A3。

1.5.1　37 ℃加速稳定性 将A1—A3批无酚红sIPV成品取样贮存于37 ℃条件下，第0、3、7、14、21、28天检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量，与无酚红sIPV成品历史批次（批号：B1—B3）数据比较，分析2组成品稳定性趋势。

1.5.2　25 ℃长期稳定性 将A1—A3批无酚红sIPV成品取样贮存于25 ℃条件下，第0、2、4、6、8、10、12周检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量，与B1—B3批数据比较，分析2组成品稳定性趋势。

1.5.3　D抗原含量 按照药典三部通则3429相关要求，采用ELISA检测各时间点的sIPV关键指标D抗原含量。将系列稀释10、20、40、80、160、320倍的标准品和稀释适宜浓度的供试品，与包被抗体于37 ℃反应1 h后，洗板，加入检测抗体。按照常规ELISA步骤操作，反应结束后加入底物显色终止，测定吸光度（ A _450/630 ）值，用系列稀释的标准品D抗原浓度及其对应的 A _450/630 值作标准曲线，计算供试品D抗原含量。以时间为横坐标，检测值为纵坐标，绘制D抗原趋势图。

分别对A1—A3和B1—B3批无酚红sIPV成品，按照药典三部以及注册企标要求检测pH、D抗原、蛋白质含量、Vero细胞DNA残留量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞蛋白残留量、游离甲醛含量。

1.7.1　效力检测 按照药典三部通则3534相关要求，将M1—M3和A1—A3批无酚红sIPV成品（供试品）与参考疫苗（经全项检定合格并经标定使用）进行1、3、9、27倍系列稀释后，经后腿肌内注射，分别免疫Wister大鼠（雌雄各半），每个稀释度10只，0.5 mL/只。第21天经眼球采全血，5 000× g 离心10 min，分离收集血清，于56 ℃灭活30 min。检测大鼠血清中针对各型脊灰病毒的中和抗体并分别计算其半数有效剂量（median effective dose，ED ₅₀ ），计算供试品各型别的相对效力。供试品各型别ED ₅₀ 应不低于参考品。

1.7.2　中和抗体检测 分别用M1—M3和A1—A3批无酚红sIPV成品免疫大鼠，每组10只。分别于第0、21、42天共进行3次免疫，每次肌内注射0.5 mL/只。第21、42天和第3次免疫后21 d（第63天）经眼眶采全血，5 000× g 离心10 min，分离收集血清。采用微量细胞病变法测定大鼠中和抗体水平。将待检血清1∶4稀释，于56 ℃灭活30 min，在96孔细胞板中加入待检血清，2倍系列稀释到所需稀释度，每份血清同时平行接种2孔，分别加入sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型稀释成2 000 CCID ₅₀ /mL攻击用病毒，同型血清加入同型病毒液，每孔0.05 mL。混匀后于35 ℃ 5% CO ₂ 培养箱中和3 h，接种（1.0~2.5）×10 ⁵ mL ^-1 的细胞悬液0.1 mL，混匀后置于35 ℃ 5% CO ₂ 培养箱，7 d判定结果。以病毒回滴结果在640~6 400 CCID ₅₀ /mL时试验成立。孔内细胞完全病变记作阳性，无病变记作阴性，以Karber法计算中和终点，即能保护50%细胞不受100 CCID ₅₀ /0.05 mL攻击病毒感染的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度。中和抗体效价≥1∶4为阳性，＜1∶4为阴性。

采用Excel 2013软件进行 t 检验，比较A1—A3批与B1—B3批sIPV中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒D抗原含量，A1—A3与M1—M3批sIPV免疫Wistar大鼠的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型血清中和抗体几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）水平，以及A1—A3批与B1—B3批sIPV中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒D抗原含量的稳定性数据，以 P ＜0.05为差异有统计学意义。

结果显示，无酚红干粉培养基Rf1—Rf3贮存于2~8 ℃至42个月，定性结果指标外观为类白色固体粉末，澄清度为溶液澄清。贮存不同时间的培养基pH均在4.4~4.8，干燥失重不高于5%，细菌内毒素不高于10 内毒素单位（endotoxin unit，EU）/mL，需氧菌总数不高于200 CFU/g，霉菌及酵母菌总数不高于50 CFU/g，均符合药典三部相关要求及原辅料企标。定量指标结果见表1。

2.2.1　37 ℃加速稳定性 贮存在37 ℃条件下，A1—A3批sIPV中Ⅰ型D抗原含量在7 d内不低于12 D抗原单位（D antigen unit，DU）/剂，Ⅱ型D抗原含量在28 d内不低于36 DU/剂，Ⅲ型D抗原含量在28 d内不低于32 DU/剂，符合药典三部和企标要求。A1—A3与B1—B3批sIPV的Ⅰ型D抗原含量降解趋势线斜率均值分别为 - 1.733和 - 1.419，Ⅱ型分别为 - 1.781和 - 1.391，Ⅲ型分别为 - 2.229和 - 2.390，各型37 ℃加速稳定性变化差异均无统计学意义（ t 值分别为 - 1.65、 - 2.22、0.54， P 值分别为0.173、0.091、0.615），加速稳定性趋势一致（图1）。

2.2.2　25 ℃长期稳定性 室温条件下，A1—A3批sIPV中Ⅰ型D抗原含量在8周内不低于12 DU/剂，Ⅱ型D抗原含量在12周内不低于36 DU/剂，Ⅲ型D抗原含量在12周内不低于32 DU/剂，符合药典三部和企标要求。A1—A3批与B1—B3批sIPV的Ⅰ型D抗原含量降解趋势线斜率均值分别为 - 1.179和 -