溶酶体的主要功能之一是通过酸性水解酶降解来源于脂蛋白、脂滴或细胞膜等的脂质，一般认为，这种降解主要发生在溶酶体腔内，因为溶酶体膜能够通过糖链保护膜免受酸性水解酶的侵蚀。膜脂质的降解需要形成腔内小泡（ILVs），以使酸性水解酶能够接触到膜脂质。ILV的膜与其他细胞膜在成分上有所不同，富含一种特定的磷脂——双（单酰基甘油磷酸）脂（BMP），其在ILV中的磷脂含量可达70%【1】。在溶酶体的pH（4.5-5.0）条件下，BMP带负电荷，能够与某些酸性水解酶的正电区域结合。BMP介导的脂质降解对于细胞至关重要，缺乏BMP会导致神经节苷脂降解受阻，而神经节苷脂的过度积累对神经系统具有毒性【2】。此外，BMP介导的溶酶体脂质降解的动态变化被认为是神经发育和神经退行性疾病的重要标志。为了维持ILV中的BMP水平，BMP必须避免被溶酶体磷脂酶降解。那么，这种脂质是如何抵抗溶酶体的降解的呢？这与溶酶体BMP的特殊立体化学构型有关。BMP含有两个甘油分子，而溶酶体BMP的两个甘油手性碳都是S构型，而不是常见于甘油磷脂中的R构型，S,S-构型被认为能够潜在保护BMP免受溶酶体酸性磷脂酶的降解【3】。此外，理解BMP合成的关键问题在于探明细胞是如何催化形成这种特殊的S,S-构型的。一般认为，BMP是通过多步骤的途径由前体R,S-磷脂酰甘油（PG）合成的。由于前体脂质PG是BMP的异构体，其合成途径可分为两个主要步骤：甘油磷酸甘油骨架周围酰基的重排，以及R构型甘油向S构型甘油的立体转换，从而生成具有双S构型的BMP，这也是哺乳动物溶酶体中存在的BMP形式。近日，纪念斯隆凯特琳癌症研究所Tobias C. Walther实验室和Robert V. Farese, Jr.实验室等合作在Cell杂志发表了题为PLD3 and PLD4 synthesize S,S-BMP, a key phospholipid enabling lipid degradation in lysosomes 的研究文章。研究发现，溶酶体中磷脂酶PLD3和PLD4酶通过催化甘油的立体转化反应来合成S,S-BMP，缺乏这些酶会导致大脑中BMP水平下降，诱发以神经酰胺为代表的脂质积累以及溶酶体功能异常。这些异常会进一步诱发神经病理紊乱，并与阿尔茨海默病等疾病的风险增加相关。本研究揭示了PLD3/4通过调控BMP水平，在维持脂质代谢和神经稳态过程中发挥了关键作用。先前的研究表明，BMP可能由PG（磷脂酰甘油）合成，本研究在人体HMC3小胶质细胞和HEK293T细胞中测试了这一假设，发现BMP是由PG水解产生的溶-PG（lyso-PG）进一步合成的。细胞中的18:1/18:1 PG和溶-PG（而非其他甘油磷脂）的增加导致了BMP水平的显著提升，这证明了溶-PG是BMP合成的前体物质。BMP合成的一个关键方面是生成在溶酶体中稳定的S,S-BMP。作者验证了S,S-BMP是否如假设那样，比其他立体异构体在纯化的溶酶体中更为稳定。通过将R,R-、R,S-或S,S-立体异构体的18:1/18:1 BMP与HMC3细胞的溶酶体提取物共同孵育，作者发现S,S-BMP比其他立体异构体在溶酶体中更具抗降解性。进一步实验发现S,S-BMP的合成涉及溶-PG和MAG通过转磷脂化反应生成，这一过程导致甘油部分的立体反转，这种反转在酸性条件下更为明显，是合成稳定S,S-BMP所必需的步骤。接下来，作者鉴定了能够催化转磷脂化反应以产生S,S-BMP的酶。已有研究表明，磷脂酶D（PLD）类酶能够催化此类反应。相较于其他PLD，作者发现过表达PLD3或PLD4能够显著增加BMP的合成活性，而关键催化位点的突变会消除这一活性。此外，特定PLD3突变与神经退行性疾病（如脊髓小脑共济失调症和阿尔茨海默病）的发生有关，这些突变不仅影响了溶酶体定位，还削弱了BMP合成功能。探究PLD3或PLD4催化BMP合成的机制后，作者发现PLD3和PLD4酶在体外能够通过转磷脂化反应从lyso-PG和MAG底物合成S,S-BMP。通过手性衍生化和水解实验进一步验证了PLD3和PLD4所合成的BMP为S,S-立体构型，这种构型使其对溶酶体的降解具有更强的抵抗力。随后，为了验证PLD3和PLD4在细胞内是否参与BMP合成，作者使用CRISPR-Cas9基因编辑技术生成了PLD3敲除的HMC3和HEK293T细胞。通过敲除PLD3，研究发现BMP水平显著降低，进而引发溶酶体功能障碍，如神经节苷脂的积累、内含体小泡（ILV）减少以及溶酶体膜受损。此外，BMP的缺乏与溶酶体胆固醇水平升高有关，而补充S,S-BMP可以恢复这些异常。PLD3也与核酸降解功能相关，但BMP的合成受影响主要还是由于脂质代谢变化引起的。因此，PLD3和PLD4是细胞内合成BMP的关键酶，尤其是PLD3在HMC3和HEK293T细胞中作用更为重要。此外，PLD3和PLD4的功能在体内具有冗余性，但在不同组织中，它们的表达和功能各有侧重。PLD3在中枢神经系统中高度表达，敲除PLD3会导致小鼠大脑中BMP水平显著降低，并伴随神经节苷脂的积累。而PLD4则在脾脏和髓样细胞中表达较高，敲除PLD4会导致脾脏中的BMP水平大幅下降，并引起神经节苷脂的积累及脾脏肿大。这些结果揭示了PLD3和PLD4在不同组织中的特异功能，及其对BMP代谢和神经节苷脂降解的调控作用。综上所述，本研究探讨了磷脂酶D3 (PLD3) 和磷脂酶D4 (PLD4) 在生理条件下催化lyso-PG和MAG 转化为双磷脂酸 (BMP) 的机制，揭示了它们在溶酶体BMP合成及脂质代谢中的作用，并通过小鼠模型展示了它们在神经系统和免疫系统中的独特功能。这些发现有助于理解PLD3和PLD4异常所导致的相关疾病的发病机制，并为未来开发治疗策略提供了理论基础。原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.036
制版人：十一
1. Kobayashi, T., et al. (2002). Separation and characterization of late endosomal membrane domains. J. Biol. Chem. 277, 32157–32164.
2. Schulze, H., and Sandhoff, K. (2014). Sphingolipids and lysosomal pathologies. Biochim. Biophys. Acta 1841, 799–810.
3. Gruenberg, J. (2020). Life in the lumen: The multivesicular endosome. Traffic 21, 76–93.
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