基于类淀粉样蛋白基质复合物与无定形磷酸钙的牙齿硬组织仿生再矿化

牙釉质龋齿以及牙本质小管暴露引起的牙本质过敏 （ DH ） 是常见的牙齿硬组织疾病。目前的治疗方法如定期应用氟化物和树脂浸润虽然可以在一定程度上预防和治疗早期牙釉质病变，然而，氟化物的防龋作用有限，只能修复表面的龋损，不能深入渗透和密封牙本质小管 （ DT ） ，过量的氟化物摄入可能导致再矿化层变薄从而引起氟斑牙等问题；此外，由于反复脱矿和聚合收缩带来的不适，也为树脂渗透带来了挑战。

基于此，来自 陕西师范大学杨鹏教授团队和天津医科大学 口腔医学院张旭教授团队 研究了一种有机 - 无机复合基质的仿生矿 化材料。该材料以 Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) 与稳定的无定形磷酸钙（ ACP ）相结合的 （ ACP@TCEP ）纳米粒子作为其无机组分，并催化聚乙二醇（ PEG ）共价接枝溶菌酶（ lyso-PEG ）分子内的二硫键断裂，促进与 ACP 纳米配合物（ ACP@lyso-PEG ）形成淀粉样蛋白基质复合材料。 ACP@lyso-PEG 纳米复合物可以快速有效地在受损牙硬组织表面形成类似牙釉质的再矿化层，为牙釉质修复或 DT 闭塞提供了有效途径，并为生物矿化形成的机制研究提供了潜在的帮助。

首先，研究团队利用分子动力学模拟（ MD ）模拟了 TCEP 与 ACP 的相互作用。模拟结果表明随着反应的进行，系统经历了一个快速的自组装阶段，离子不断聚集并最终形成了具有不同枝晶形状的纳米颗粒， ACP@TCEP 纳米粒子的形成机制如下： 1)TCEP 的去质子化羧基与 Ca ²⁺ 形成配位键，并稳定结合在一起； 2) TCEP 去质子化羧基通过配位键与 Ca ²⁺ 结合后， Ca ²⁺ 与 HPO ₄ ^2- 配位。在这种结合模式下， Ca ²⁺ 作为桥梁，将 TCEP 和 HPO ₄ ^2- 连接在一起。这两种结合方式的配位键长在 2.3-2.6Å 之间（图 1g ）。通过这些结合方法， TCEP 、 Ca ²⁺ 和 HPO ₄ ^2- 形成一个网络结构，牢固地锁定在结合位点的构象上，最终形成纳米颗粒。

材料制备上，团队首先研究了 TCEP 浓度、钙磷摩尔比和溶液 pH 对 ACP 稳定效果的影响，综合考虑晶体转变的能量势垒，最终选择了 10:6 的钙 - 磷酸体系、 6.5 的 pH 值进行后续实验。然后对制备的 ACP@TCEP 纳米颗粒进行表征，等温滴定量热法（ ITC ）说明了反应在热力学条件下结合过程的适宜性和自发性（图 2b ）；动态光散射（ DLS ）测量的粒径和多分散性指数表明 ACP@TCEP 纳米颗粒具有相对稳定的粒径，尺寸在 30 至 60 nm 之间；选择区域电子衍射（ SAED ）证实了 ACP@TCEP 纳米颗粒为非晶相 ( 图 2f) ，此外，元素图显示，钙和磷在 ACP@TCEP 纳米颗粒内部分布均匀 ( 图 2g,h) 。更重要的是， ACP@TCEP 纳米颗粒的稳定时间在一年以上，与现有的稳定剂如 PCBAA （ 3 天）、 CMC （ 1 周）相比，不仅为快速的仿生矿化提供稳定的钙供应，而且避免了繁琐的矿化过程。

然后为了进一步模拟自然界中发现的矿化过程并提供有机模板，研究团队将 ACP@TECP 纳米颗粒引入 lyso-PEG 溶液中制备 ACP@lyso-PEG 纳米配合物。 DLS 表征结果表明随着 pH 的增加，溶液的多分散性指数（ PDI ）接近 0.3 时趋于稳定，样品体系分散均匀 ( 图 3b) 。透射电镜和相应的元素图表明， ACP@lysoPEG 纳米配合物中氮 (N) 、磷和钙分布均匀，并仍保持非晶形态 ( 图 3f) 。在加入改性模拟口腔液（ m-SOF ）后， ACP@lyso-PEG 纳米配合物的稳定性迅速降低， ACP 在水环境中转变为结晶相 HAp 晶体， XRD 图谱与能量色散 X 射线能谱（ EDS ）证实了这一点（图 3k,i ）。

接着为了评估 TCEP 对 ACP@lyso-PEG 纳米配合物中二硫键的还原作用，研究团队加入 TCEP 后，在 A CP@lyso-PEG 纳米配合物中引入了能够检测游离巯基的 N- （ 1- 芘基 ） 马来酰亚胺 （ NPM ） 染料。 NPM 染色样品的荧光逐渐增强并达到平衡，表明在相变过程中二硫键的减少 ( 图 4a ) 。通过苯胺萘 - 1- 磺酸 （ A NS ） （ 图 4b ） 和硫黄酮 T （ ThT ） 染料 （ 图 4c ） 染色来识别反应溶液中疏水性基团的暴露状态和 β-sheet 含量。 两者的荧光强度曲线均呈现连续增加，最终达到稳定，为疏水性基团的 暴露和 NPM 的形成提供了证据。同时，研究表明该复合材料展现 出良 好的透明度。

之后研究团队将 ACP@lyso-PEG 纳米复合物涂抹在脱矿牙齿上，以研究它们促进再矿化的潜力。与没有出现明显矿化层的空白组和氟（ 0.2% 氟化钠）（图 5b ）、酪蛋白磷酸肽 (CPP)-ACP （图 5c ）、溶酶 peg 处理的对照组（图 5d ）相比， ACP@lyso-PEG 纳米配合物上形成致密有序的棒状矿物晶体，并且经 ACP@lyso-PEG 纳米配合物处理后，牙釉质样品的硬度和弹性模量分别恢复到 3.804±0.55 GPa 和 73.988±4.53 GPa ，与正常牙釉质非常接近，这表明实现了酸蚀牙釉质表面 HAp 晶体的完全再生。同时团队研究了 ACP@lyso-PEG 纳米配合物处理后在酸蚀牙釉质表面的晶体生长速率。再矿化 24 小时后，酸蚀牙釉质表面矿物层覆盖均匀致密， 48 小时后矿化层厚度 ≈2 μm( 图 5i ₂ ) 。在 ACP@lysoPEG 纳米复合物处理组，声音牙釉质中的再生矿物质向牙釉质表面生长。矿化 72 小时后，厚度达到 ≈4.205 μm( 图 5i ₃ ) ，进一步验证了该仿生策略在制造复合基质材料方面的优势。

同时，为了确定材料是否可以用于闭塞 DT ，研究团队使用不同材料处理了牙本质表面并进行观察分析。在脱矿的牙本质中，大多数乳头状瘤仍然暴露在外（图 6a ）；经过商业脱敏剂处理的脱矿牙本质，只有一小部分表面被密封，大量 DT 保持开放状态（图 6b ）； lyso-PEG 涂层处理后，脱矿牙本质的表面覆盖率显著增加（图 6c ），然而，即使在再矿化 5 天后，也不能完全关闭 DT 。相比之下， ACP@lyso-PEG 纳米复合物实现了对暴露的 DT 的完全闭塞，明显优于其他组（图 6d ）。

最后，研究团队设计了体内动物实验来评估 ACP@lyso-PEG 纳米复合物在牙釉质再矿化和牙釉质咬合中的临床性能。将未经处理的酸蚀牙釉质和脱矿牙釉质（空白组）、氟处理的脱矿牙釉质、商用脱敏剂处理的牙釉质以及 ACP@lyso-PEG 纳米复合物处理的牙釉质植入大鼠的腭内 2 周（图 7a ）后收集牙釉质和牙本质标本并固定，进行进一步的 SEM 和 micro-CT 分析。结果表明，相较于传统的氟化物则需要利用残留的矿物晶体对早期牙釉质病变进行再矿化，通过仿生策制备的新材料可以直接将 ACP 输送到脱矿牙釉质和牙本质表面，具有良好的临床应用意义。

该研究受人体固有矿化过程的启发，提出了一种仿生有机 - 无机复合基质矿化策略。利用 TCEP 的多用途属性，设计了复合 ACP@lyso-PEG 纳米复合物。 TCEP 为 ACP 促进的仿生矿化过程提供了多种必需的矿物成分，同时通过与 Ca ²⁺ 的结合相互作用来稳定 ACP 纳米颗粒，这使得该纳米复合物有望成为抑制和预防龋齿的治疗方法。

本研究由陕西师范大学杨鹏教授团队和天津医科大学口腔医学院张旭教授团队合作完成，并于 2024 年 5 月 25 日在线发表于 Adv. Funct. Mate r 。

文献信息： Yanyun Pang, Che ngyu Fu, Daixing Zhang, Min Li, Xinye Zhou, Yingtao Gao, Kaiye Lin, Bowen Hu , Kai Zhang, Qing Cai, Peng Yang*, Yongchun Liu*, and Xu Zhang*. Biomimetic Remineralization of Dental Hard Tissues via Amyloid-Like Protein Matrix Composite with Amorphous Calcium Phosphate. Adv Funct Mater 2024, 2403233.

供稿：许雅豪

审校：陈嵩

编辑：许雅豪