*仅供医学专业人士阅读参考
朊病毒病是一种由内源性朊病毒蛋白PrP的错误折叠引起的罕见致命性神经退行性疾病，包括克雅氏病（CJD）、致死性家族性失眠症（FFI）、克鲁氏症等。这些疾病可以通过自发、遗传传递或感染传播（例如疯牛病）发生。目前朊病毒病尚无行之有效的治疗方法，不过动物实验为我们指明了方向，即通过降低神经元中PrP的表达可以阻止疾病进展。
美国麻省理工学院的Jonathan S. Weissman和Broad研究所的Sonia Vallabh等人前几日发表在顶刊《科学》的最新论文[1]，首次展示了一种名为CHARM（Coupled Histone tail for Autoinhibition Release of Methyltransferase）的表观遗传编辑技术。
CHARM系统通过腺相关病毒（AAV）进行递送，可以在不改变基因组序列的情况下，持久关闭小鼠大脑中的朊病毒蛋白表达，导致全脑范围内高达80%的朊病毒蛋白减少，这个下降程度远远超过实现朊病毒病治疗效果所需的最低标准。而且CHARM系统能够在完成任务后自动减少或停止自身的表达，极大地降低长期表达可能引起的副作用。
论文首页截图
反义寡核苷酸（ASO）技术可以通过一段短链的核酸片段与Prnp（PrP的编码基因）的mRNA结合，阻止其翻译，已被证明可以降低小鼠的大脑朊病毒水平，阻止病情进展和逆转症状。ASO通常通过注射递送到体内，可以直接进入细胞并与目标mRNA结合，然而ASO需要持续且定期地进行脊髓内注射，其疗效有限。
要想阻止Prnp的转录、进行基因沉默，还可以通过甲基化修饰来实现。
2021年，Jonathan Weissman等人开发了一种基于CRISPR技术的表观遗传编辑工具，CRISPRoff[2]。CRISPRoff系统使用去活化的Cas9蛋白（dCas9）与DNA甲基转移酶催化域等组分形成复合体，在sgRNA引导下结合到目标基因（Prnp）的启动子区域后在DNA上添加甲基化标记，阻止转录因子的结合，实现更持久稳定的基因沉默。
CRISPRoff系统的原理[2]
遗憾的是，CRISPRoff虽然弥补了ASO技术的部分缺陷，递送环节又出了问题。CRISPRoff由于系统复杂且尺寸较大，难以通过腺相关病毒（AAV）进行高效递送。AAV是大脑基因治疗中被广泛使用的递送载体，装载容量限制大约为4.7kb，而CRISPRoff系统的构建通常超过这一大小，导致其临床应用受限。
于是，为了克服这一障碍，研究团队打算放弃CRISPR，尝试使用比dCas9体积更小的DNA结合蛋白。
比如他们此次开发的新型表观遗传编辑工具CHARM，是利用锌指蛋白（ZFP）来抓住Prnp的启动子。
CHARM系统由几个关键部分组成，包括一个DNA结合域（锌指蛋白）、Dnmt3l非催化域，以及组蛋白H3的尾部。其中，锌指蛋白负责带路定位到Prnp的启动子区域，Dnmt3l负责招募细胞内源性的DNA甲基转移酶（比如DNMT3A），组蛋白H3尾部负责激活这些甲基转移酶。如此一来，CHARM系统对Prnp的启动子完成表观遗传编辑，导致其高甲基化，使降低表达活性、实现基因沉默。
CHARM系统的组成和原理[3]
锌指蛋白是真核生物中普遍存在的DNA结合蛋白，具有模块化特性，即它们能够通过不同的组合和配置精确地靶向基因组中特定的序列，这种特性让锌指蛋白成为一件得心趁手的基因编辑工具。再加上其它组分构成，使得CHARM系统比CRISPRoff系统显现出一些优势。
首先是解决了尺寸的问题，CHARM系统的设计，特别是锌指蛋白的尺寸更为紧凑，适合以AAV作为载体进行传递。其次，相比于来源于细菌的Cas9，神经元不会拿锌指蛋白当外人，免疫原性降低。还有毒性方面，CRISPRoff系统自带的甲基转移酶催化域在细胞内过表达时具有细胞毒性，而CHARM系统是调用细胞内源性甲基转移酶（平时没有活性），因此在细胞内表现出较低的毒性。
体外实验（HEK293T细胞）和小鼠体内实验验证结果表明，CHARM能够对Prnp启动子区域进行广泛的DNA甲基化，并持久有效地沉默目标基因Prnp，效果与CRISPRoff相当，但细胞毒性、脱靶效应更小。
研究团队给成年小鼠眼眶后注射携带CHARM系统的AAV载体时，在注射6周后收集并分析小鼠的大脑样本，结果观察到CHARM系统将整个大脑中的Prnp转录本水平降低70%-90%，同时PrP蛋白表达也下降60%-80%，任何给药剂量下均未检测到不良反应。
可以有效进行甲基化修饰、减少全脑PrP水平，毒性小
这一下调效果远超过实现朊病毒病治疗效果所需的最低标准。以往研究中，通过ASO技术将PrP表达下调50%能够延长多个朊病毒病动物模型的生存期，下调21%便可以延迟症状发作。
不止于此，研究团队还对CHARM进行了一个小升级，为CHARM系统设定了到点儿就下班的闹钟。
他们在CHARM自身启动子区域引入了锌指蛋白的结合位点，这样，一旦CHARM系统开始表达，不仅会对目标基因进行有效沉默，还能防止自身的持续表达，避免因长期表达而可能引发的免疫反应和脱靶效应。小鼠实验结果显示，CHARM自身表达减少甚至停止的话，Prnp的沉默效果依然持久。
CHARM系统干完活就下班，不会再打扰细胞
该研究首次证明，利用AAV将表观遗传编辑工具进行递送，能够在大脑中对DNA进行可控甲基化，从而持久有效地沉默目标基因。
对于研究团队而言，这项研究成果具有更深的意义[4]——Sonia Vallabh遗传有致命性家族失眠症的致病基因，于是她与她的丈夫Eric Vallabh Minikel在12年前开始专注于寻求这种疾病的治疗方法。该论文另一名通讯作者Jonathan S. Weissman则补充道，CHARM系统还可能用于治疗由异常蛋白质累积引起的其他疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病。
研究团队表示，下一步要做的，就是探索CHARM系统如何在可以靶向人类大脑神经元的AAV载体中发挥作用，这将是重大挑战。
参考文献：
[1]https://www.science.org/doi/10.1126/science.ado7082
[2]J. K. Nuñez, J. Chen, G. C. Pommier, J. Z. Cogan, J. M. Replogle, C. Adriaens, G. N. Ramadoss, Q. Shi, K. L. Hung, A. J. Samelson, A. N. Pogson, J. Y. S. Kim, A. Chung, M. D. Leonetti, H. Y. Chang, M. Kampmann, B. E. Bernstein, V. Hovestadt, L. A. Gilbert, J. S. Weissman, Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell 184, 2503–2519.e17 (2021).
[3]Whittaker, M. N., & Musunuru, K. (2024). An epigenetic editor to silence genes. Science (New York, N.Y.), 384(6703), 1407–1408. https://doi.org/10.1126/science.adq3334
[4]https://www.nature.com/articles/d41586-024-02115-z
本文作者丨张艾迪
