超越天然抗体：强大的体外展示技术

在过去近40年中，杂交瘤技术为筛选单克隆抗体以用于研究和诊断提供了强大工具。除了对传统的制备单克隆抗体的方法改进之外，研究人员还受益于体外展示技术的发展。虽然尚未得到充分的应用，但展示技术比动物免疫更能灵活控制抗体的性质。

高通量生物学的出现大大增加了对可再生，高质量亲和试剂，如抗体的需求。随着动物免疫技术的发展空间预计将变得越来越狭小，体外方法有可能大大提高抗体筛选的并行化，自动化和小型化。此外，最近一些论文指出，商业化特异性差的抗体的比例非常高。鉴于现代生物学研究越来越依赖商业化抗体的保真度，这突出了改进方法以提高抗体质量的重要性。体外展示技术结合高通量筛选有望成为大规模抗体制备的理想平台。

在此，我们将讨论体外展示技术的应用范围，特别是在区分序列和构象差异甚微的蛋白，甚至结构相似的小分子的能力。我们将阐述体外展示技术如何产生具有高质量的抗体，其中一些从未通过动物免疫获得。

通过对选择和筛选条件的控制，展示技术可以针对特定的抗原构象或表位产生抗体（图1）。例如，通过加入竞争物，可以筛选靶向指定表位的抗体。因为抗体和其编码的基因偶联在一起，所以体外展示技术允许快速对抗体进行各种后续改造。同时可以通过构建突变的亚库以产生特异性和亲和力更优越的抗体。许多研究报道通过展示技术获得皮摩尔级（pM）亲和力的抗体，甚至一项研究报道获得飞摩尔（fM）级亲和力的抗体。这些亲和力远高于通过动物免疫获得的抗体的亲和力，因为受B细胞生理机制限制，天然抗体的亲和力上限约为100 pM。

由于体外技术基于微生物系统，因此比基于杂交瘤（hybridoma）的方法更适合于自动化和高通量化。此外，体外方法还克服了免疫耐受性，允许筛选高度保守靶点，如泛素，组蛋白等。

图1 体外筛选的优势

单一的甲基或羟基可以对类固醇激素的生物学特性产生相当大的影响。类似地，蛋白质磷酸化（phosphorylation），乙酰化（acetylation）和磺化（sulfation）等翻译后修饰可以显着影响信号转导。开发能够识别这些相对简单的化学修饰的抗体在生物学研究方面具有重要价值。虽然通过传统免疫接种可以获得识别小分子特异性的单抗或多抗，然而，通过控制选择条件，在辨别相关小分子之间微小差异方面，展示技术产生的抗体远远优于通过免疫获得的抗体（图2）。

图2 体外筛选可以发现识别微小差异小分子的抗体。（a）特异性识别海洛因代谢物6-单乙酰吗啡，而不识别相似的吗啡的抗体。（b）特异性结合17β-雌二醇，睾酮和孕酮，而与相似的类固醇无交叉反应的抗体。（c）识别磺化酪氨酸而非酪氨酸或磷酸化酪氨酸的蛋白的抗体。

一个典型例子是使用噬菌体展示来研究磺化酪氨酸。约30％的分泌和膜蛋白被预测发生酪氨酸残基的磺化。包括使用动物免疫技术在内，数十年尝试已证明不可能使用传统手段产生识别磺化酪氨酸的抗体。这可能是由于对这种蛋白质修饰的免疫耐受性，以及在分泌途径中由于识别的靶点的存在，导致抗体无法分泌。利用噬菌体展示技术，最近两组研究报道了可以识别含有磺化酪氨酸（而非磷酸化酪氨酸）的抗体，它们序列完全不相同。这些抗体在western blot分析，免疫荧光，酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫沉淀法中均能识别含磺化酪氨酸的蛋白质，并且可以通过硫酸酯酶处理或与游离的酪氨酸硫酸盐预孵育来消除识别。与传统方法需要对放射性标记的蛋白质水解产物进行薄层层析或质谱分析相比，该技术提供了无与伦比的优势。

体外展示技术允许针对几乎任何靶点，包括毒素，病原菌和抗原，产生抗体，即使它们不具有免疫原性或高度保守的。体外筛选的抗体能区分细微的差异，如表1，可以区分鸡和鹌鹑溶菌酶（蛋白表面仅一个氨基酸不同）的抗体，区分ABL1和ABL2的SH2结构域（89％的序列相似性）的抗体等。

表1 通过体外筛选技术获得的识别特定蛋白构象和序列的抗体

变构是一种常见的蛋白功能调控方式。信号通路中的许多蛋白通过变换构象以介导不同细胞途径。因此，识别不同构象的抗体成为研究细胞信号转导的强大工具（表2）。然而，由于在动物体内难以维持蛋白特定构象，从而难以获得针对特定构象的抗体。两种体外筛选技术可以解决这个问题：利用负筛选去除非特异性结合和结合非感兴趣构象的抗体，然后通过亲和力成熟的策略进一步优化特异性。在一项研究中，利用突变将GTP固定在GTP酶Rab6中，通过针对该突变体的筛选，一种特异性识别结合GTP构象的Rab6蛋白的scFv（single-chain variable fragment）被成功得到。在另一项研究中，Sidhu等人用小分子化合物锁定活性或非活性构象的caspase-1，并成功筛选出特异性识别“开”或“关”状态下caspase-1的Fab（fragment antigen-binding）。此外，体外筛选技术还被用于全细胞筛选，即在不同刺激条件下筛选针对膜表面蛋白不同构象的抗体。

噬菌体展示技术还被用于发现识别不同结构RNA的抗体，而这种RNA基本上是非免疫原性的，并且不适于使用简单的核苷酸探针进行检测（表2）。通过建立无核酸酶，优化的RNA稳定结构的体外环境，人们筛选得到了针对四膜虫组I（Tetrahymena group I）内含子的结构域的高亲和力Fab。这些研究建立了适用于产生针对其他结构化RNA抗体的通用方法，并且可用于揭示在后生动物转录组中发现的大量非编码RNA的生物学作用。

细胞间的交流主要由细胞表面受体和对应的配体之间的相互作用调控。抗体可以改变这种相互作用，并且许多治疗性抗体通过使用不同的机制干扰细胞表面的通信来发挥其作用（图3和表2）。体外展示技术为产生干扰正常或病理性细胞外信号转导的功能性抗体提供了有力工具。虽然难以直接进行功能筛选，但展示技术可以获得成百上千的抗体，然后可以对其进行功能筛选。例如，通过噬菌体展示产生> 1,200种针对B淋巴细胞刺激物（B-lymphocyte stimulator, BLyS）的不同抗体。随后使用生化和细胞实验从中筛选与BLyS结合并抑制其与配体相互作用的抗体，从而阻断B细胞活化（图3a）。在一些研究中，人们甚至直接从初始噬菌体展示文库中分离出亚纳摩尔级（nM）亲和力的抗体。其中，一种仅针对分泌形式的BLyS（Benlysta）的抗体经过亲和力成熟后，已接近批准用于治疗系统性红斑狼疮。另一项报道中，噬菌体展示文库被用于筛选28个不同的潜在治疗靶点的抗体，每个靶点平均筛选出了120个有功能活性（即拮抗或激动）的抗体。

图3 抗体抑制或激活细胞表面受体的模式图

表2 通过体外筛选技术获得的针对细胞表面受体的抗体

抗体在阻断病毒侵染中的蛋白质相互作用方面也具有很大的潜力。一项研究中，人们从天然抗体库中筛选出靶向重组流感血凝素5（hemagglutinin 5, H5）胞外域的抗体。结构分析表明，其中一个抗体结合位点位于多株流感病毒中高度保守的、以前未被发现的口袋中。抗体结合抑制了膜融合，使病毒被中和。尽管传统免疫或感染未能产生针对该表位的抗体，然而，从最近感染的个体产生的噬菌体抗体文库中，具有相似VH基因和病毒中和能力的抗体已经被筛选出。这些研究表明，噬菌体展示技术可以获得比传统免疫更多的多样性。

通过设计体外筛选方式还可以直接筛选介导内吞的抗体。该方法通过将噬菌体文库与靶细胞共同孵育，去除结合细胞表面的噬菌体之后，分离出细胞内的噬菌体抗体。最后，筛选后再鉴定被识别的抗原。或者，使用靶点转染的哺乳动物细胞或者靶点表面展示的酵母进行筛选，该方法特别适用于筛选用于特异性靶向的抗体化疗药物。

总之，抗体和其他结合分子通过特异性干扰蛋白质相互作用来提供调节生物学功能的方法。体外展示技术提供了筛选针对蛋白特定构象抗体的方法，甚至包括在细胞表面上的靶点。 这有助于快速筛选潜在的稀有的功能性抗体。

尽管初筛得到的抗体可以直接用作亲和试剂，但体外方法的一个优势是可以通过构建二级文库进一步提高功能。二级文库最常用来提高亲和力，并且所有三种形式的库（噬菌体，酵母和核糖体）都已被应用于开发超越天然抗体亲和力的抗体（表3）。虽然逐步法和计算机法都被用于产生类似的高亲和力的抗体，但它们均没有像体外展示方法那样被广泛应用。目前有许多体外亲和力成熟的例子，这里我们仅列举一些关键的研究。在核糖体展示中，每步筛选都包含PCR扩增，因此可以通过易错PCR引入新的突变。该策略已被用于筛选亚纳摩尔级亲和力的抗胰岛素抗体。酵母展示文库比噬菌体和核糖体文库更小，但它可以通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）进行高通量筛选。经过多轮易错PCR，从包含10⁵-10⁷个不同克隆的文库中已筛选出抗荧光素scFv，其亲和力成熟至<100 fM。

表3 通过体外筛选技术提高抗体亲和力和特异性

人们通常利用抗体工程力求获得高抗原特异性的抗体。然而在某些应用中，交叉反应发挥着重要作用。例如，物种间交叉反应可以更好地在动物模型中评估抗体治疗功效和毒性。不幸的是，由于免疫耐受，交叉反应性抗体通常难以通过杂交瘤方法获得。相反，体外文库不受免疫耐受的影响，并且开发针对跨物种的保守位点的抗体被证明是完全可行的。对于高度保守的蛋白，如血管内皮生长因子（VEGF），人/小鼠交叉反应性抗体可以直接从天然库中获得。对于较不保守的直系同源蛋白，如BAFF/BLyS receptor 3（BR3），研究者们先从天然库中获得了与小鼠蛋白交叉反应性较弱的人抗体，接着体外进化为高度交叉反应性的抗体。类似的方法还产生了同时识别两个密切相关的趋化因子（C-X-C motif ligand 10 and C-X-C motif 9）的抗体，从而可以使用单一抗体中和两种人趋化因子。

目前大多数对抗体交叉反应的改造是针对同源蛋白之间的。然而一个极端案例中，曲妥珠单抗（trastuzumab）被改造成可以交叉识别两种差异非常大的蛋白，VEGF以及其原始靶点ErbB2（图4）。经过相当程度的进化，两个靶点，VEGF和ErbB2的亲和力分别达到K_d = 3 和0.2 nM。该抗体可以同时抑制VEGF和ErbB2介导的体外细胞增殖和小鼠模型中的肿瘤进展。结构学表明，该抗体Fab与ErbB2结合位点主要位于VH上，与VEGF结合位点则主要位于VL上。针对结构不相关抗原的双特异性抗体在治疗领域可能具有重要意义，因为可以使用一种抗体同时作用于不同信号通路。

图4抗VEGF和ErbB2双特异性Fab。ErbB2（橙色，PDB ID: 3BDY），VEGF（红色，PDB ID: 3BE1），Fab重链和轻链分别为青色/灰色和蓝色/黑色。

提高亲和力和扩大特异性对治疗感染疾病的抗体的开发也具有重要意义。为了有效抑制病毒感染和细菌毒素，抗体应具有高亲和力同时可以识别各种抗原亚型，以提供对各种病原体变体的广泛保护。此外，多项研究表明，针对不同表位的多种抗体联用提供了有效中和病原体所必需的协同效应。体外抗体技术为达到这些苛刻标准提供了有效的手段。例如一项长期研究针对肉毒杆菌神经毒素的中和抗体的研究中，研究者从免疫小鼠和人中构建了噬菌体抗体文库。从该文库中成功筛选出针对肉毒杆菌神经毒素三个不同表位的抗体。联合使用这三种抗体显示出强大的协同效应，显著增加了毒素中和能力。另一个例子中，利用酵母展示技术经过多轮亲和力和特异性成熟，一种能同时识别肉毒毒素A，B，E和F的抗体最终被筛选出来。

所有体外筛选系统可以立即获取针对特定靶点的抗体的基因和对应的蛋白序列。而后通过简单的亚克隆可以方便地进行改造，包括二聚化，多聚化，还可以与酶，标签或荧光蛋白融合表达（图1）。与碱性磷酸酶的融合是改进抗体功能的一个十分实用的例子。由于是一种二聚体酶，与碱性磷酸酶融合的抗体同时促进了二聚化和赋予了碱性磷酸酶活性，极大地促进了筛选，增加了有效亲和力，避免了二次试剂的需要。抗体片段的C末端融合短肽作为生物素标签，可以实现位点特异性生物素化和多聚化。抗体片段也可以转化成全长抗体或scFv-Fc融合蛋白，同时一些性质保持不变。使用工程化的Fc区域可以改善药代动力学和效应功能。在双特异性抗体设计中，改造后的两个不同Fc片段仅允许异源配对。

微注射抗体长期以来被用于调节细胞内功能。抗体片段可以在靶细胞内表达，并通过添加合适的信号序列靶向各种亚细胞区域，实现在不同区域中蛋白质的可视化或功能性修饰。例如，去除信号序列导致抗体停留在细胞质中，而添加核定位信号导致抗体转移至细胞核。前导序列和内质网（ER）保留序列组合使抗体保留在ER中，并且已经被用于将膜蛋白固定在ER中。这些包括人白细胞介素2受体，ErbB2受体，β-淀粉样前体蛋白，血管粘附分子1等。

由于胞内还原环境和缺乏特定分子伴侣（防止二硫键形成），抗体片段在细胞质中的正确折叠具有一定挑战性。尽管如此，仍有细胞质蛋白靶点被细胞内scFv靶向的例子。通过构建高度稳定的scFv的文库，预筛选可以在细胞质表达的抗体，或者使用不依赖二硫键的分子骨架的文库（如工程化的锚蛋白重复蛋白）。利用抗体阻断靶蛋白功能的一个重要优点是它们能够产生空间特异性结合，以区分十分相似的蛋白。

体外展示技术的简易性使得体外抗体筛选比杂交瘤更简单和更快。通常，一组ELISA阳性单克隆抗体片段可在2周内获得。早期的实验证明了从噬菌体文库中半自动筛选少量靶点的可行性。最近的研究则成功地对大于400种不同抗原进行了筛选，其中54％的细菌产生的抗原和88％的哺乳动物产生的抗原筛出了抗体。两种蛋白类别之间的差异可能是由折叠水平的差异引起的。

如果体外筛选获得的抗体如此强大，为什么它们仍没被广泛应用？部分原因在于专利情况，导致这种技术限制在高利润率的治疗市场。相比之下，杂交瘤技术从未申请专利，因而能在短时间内获得了较广泛的认可。然而，一些噬菌体展示核心专利的情况现在正在迅速改变，因为大多数平台专利已经或在未来几年内到期。因此，这项技术可能会因此而得到更广泛的传播。

尽管很大程度上还没有被意识到，值得强调的是，一些所谓商业化的“单克隆抗体”实际上是通过噬菌体展示技术获得的重组抗体，即通过Fc区与人可变区的融合而形成的看起来像传统的鼠抗体（例如，上述磺化酪氨酸识别抗体）。事实上，通过噬菌体展示筛选的未修饰的重组Fab片段是可买到的。目前另一大障碍是缺乏对这种技术的了解，加上有限的专业知识和文库。此外，与180家从事免疫接种制备抗体的公司相比，愿意进行体外筛选的公司的数量微乎其微。

体外展示技术被低估的另一个原因涉及到一些蛋白表达的困难。尽管上述的一些抗体具有显著特异性，但是抗体片段的表达和稳定性差别很大，既有临床试验中使用的十分稳定的scFv片段，也有表达量极低的一些抗体片段。一次典型的筛选几乎总是产生多个不同的抗体。其中，通常至少有一个足够稳定，产量较好可以应用的。此外，通过对文库中抗体骨架的优化，可以提高预期稳定性和表达水平。上述研究表明，只要使用足够多样性和优化的文库，这个目标可以在平行筛选中满足。此外，稳定性和表达量筛选可以容易地整合在高通量筛选过程中。另一个问题是，在细菌中表达的抗体是非糖基化的，而在传统酵母中表达则导致非正确糖基化。如果需要正确的糖基化，则可以在人类细胞或改造的可以表达人糖基化模式的酵母中表达。

一旦抗体产生，就可以通过序列来精确定义，甚至预先确定序列分布。基因合成技术正在以惊人的速度发展，其成本已大幅下降。实际上，现在已可以合成目标抗体片段序列的基因，其价格低于从传统供应商购买某些抗体。

该领域的现状可以与人类基因组计划开始时测序技术的情况进行比较。正如人类基因组计划一旦开始实施并采用严格的工业程序所取得的巨大技术进步一样，一旦项目启动和融资完成，我们预期抗体在筛选，下游使用等所有方面将取得重大进展。总之，体外展示技术允许通过大量“通用”或免疫展示文库中的数十亿潜在抗体来容易地产生所需抗体。这些技术促进了抗体的生产，筛选和成熟，并允许筛选特定靶点构象和抗体形式，而这是基于传统动物免疫所不可能的。此外，基因序列的简单获取性不仅提供了抗体的确定性描述，而且还允许通过共享电子版基因序列，利用基因合成制备抗体。近20年来，展示技术成功地被应用于治疗性抗体候选物的开发。在接下来的十年里，我们也期望在研究和诊断领域中更多地发掘该技术的优势。

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来源：Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies (PMID: 21390033)