The Plant Journal | 双重防御机制解密：聚合草中PAs生物合成

在 The Plant Journal 上最新发表的研究中，一项突破性的发现解开了聚合草( Symphytum officinale )中吡咯里西啶类生物碱（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）生物合成的独特双酶机制，这一发现不仅揭示了植物次生代谢途径的复杂性，还为农业作物改良和降低植物毒素开辟了新途径。

吡咯里西啶类生物碱（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一类由特定植物合成的含氮次生代谢产物，以其独特的吡咯啉环结构而闻名，在植物化学防御系统中扮演着至关重要的角色，有助于抵御食草动物和病原体的侵害。然而，它们也具有显著的毒性，能够对人类和动物造成危害，尤其是通过食物链摄入时可能导致严重的健康问题。因此，对吡咯里西啶类生物碱的研究不仅有助于揭示植物的自我保护机制，还对确保食品和药品的安全性具有重要的实际意义。

图1  推测的吡咯里西啶类生物碱(PAs)生物合成途径

研究人员发现了两种高亚精胺氧化酶（HSO）同源基因 SoCuAO1 和 SoCuAO5 ，它们在聚合草的不同器官中独立参与PAs的生物合成。通过转录组测序技术（RNAseq），他们鉴定并确认了两个同源基因 SoCuAO1 和 SoCuAO5 作为高亚精胺氧化酶（HSO）的候选基因。 SoCuAO1 和 SoCuAO5 与聚合草中PAs生物合成关键酶HSS（ SoHSS ）的具有一致的共表达模式： SoCuAO1 在幼叶中表达，而 SoCuAO5 在根中表达，而PAs主要在根部和幼叶中产生，表明它们在PAs生物合成中可能扮演关键角色（图2）。此外，系统发育分析显示 SoCuAO1 和 SoCuAO5 与已知的HiHSO聚类，为它们在PAs生物合成中的潜在功能提供了有力支持。

图2：RT-qPCR分析，在PAs产生和非产生组织中， HSS 和 CuAOs 基因的相对表达水平

通过RISPR/Cas9实验，研究证实了这些基因在PAs合成中的关键性，为操纵药用植物中的PAs含量提供了潜在的分子靶点。研究人员发现 SoCuAO5 基因敲除对会导致Hspd在这些毛状根株系中显著积累，而PAs则完全检测不到。这种显著的底物积累和产物缺失，为Hspd向PAs转化的关键步骤提供了直接证据，确认了 SoCuAO5 在PAs生物合成途径中不可替代的作用（图4）。此外，通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对这些株系进行的代谢分析，进一步证实了 SoCuAO5 在催化Hspd形成PAs中的独特功能。 SoCuAO5 基因敲除后的再生植物在未开花阶段未检测到PAs，但在开花阶段，在花和幼叶中观察到了PAs的合成， SoCuAO1 过表达后导致具有不同立体化学特性的PAs的产生（图5），表明 SoCuAO1 在特定组织中可能具有补充功能，为理解草本聚合草中PAs生物合成的复杂机制提供了宝贵的见解。

图4 SoCuAO5 基因敲除毛状根中Hspd和PAs水平

图5 SoCuAO5 基因敲除后植物再生过程中PAs的分析

通过对SoCuAO1和SoCuAO5进行细致的酶动力学分析，研究人员揭示了这两种酶对特定底物Hspd具有高度的亲和力和催化效率，尤其是SoCuAO5表现出比SoCuAO1更高的催化活性，此外，其催化活性还受到底物浓度的反馈调控（图6）。通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，研究人员进一步鉴定了SoCuAO1和SoCuAO5作用于Hspd后产生的反应产物，确认这两种酶能够有效催化形成吡咯啉生物碱骨架的关键中间体，即单环N-(4-氨基丁基)吡咯啉离子和1-甲酰吡咯啉的两个立体异构体（图7）。相比之下，SoCuAO2并不参与PAs生物合成，这进一步凸显了SoCuAO1和SoCuAO5在PAs生物合成中的独特作用和它们与其他CuAOs在生化特性上的差异（图7）。这些发现深化了我们对聚合草PAs生物合成途径中关键酶作用的理解。

图6 SoCuAO1、SoCuAO5和SoCuAO2与不同底物（Hspd、Spd、Put）反应的酶动力学特性

图7 通过GC-MS分析，展示了SoCuAO1和SoCuAO5孵育后的反应产物