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BioMed科技 · 公众号 · · 2025-01-29 18:25

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1型糖尿病

1型糖尿病（T1D）是一种慢性、改变生活的疾病，是由于胰腺中分泌胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏造成的。免疫系统在帮助T1D发展和进步方面至关重要。这其中，T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和调节性T（Treg）细胞通过其细胞毒性或抑制活性直接影响疾病动力学，从而为免疫调节干预提供多种治疗靶点。值得注意的是，CD8+T细胞和Treg细胞在T1D的进展中起着特别重要的作用。CD8+T细胞是负责破坏产生胰岛素的β细胞并使疾病永久化的主要效应细胞，而受损的Treg细胞无法提供足够的保护来维持对β细胞的免疫耐受。

当首次诊断出临床症状时，大约只有20%的β细胞存活。积极的治疗干预可能会保护这些残留的β细胞，从而减轻T1D的进一步恶化和发展。因此，迫切需要开发一种治疗方法来预防T1D的发展，同时尽量减少对免疫系统的不利影响。

双特异性细胞囊泡连接剂

在这项研究中， 浙江大学顾臻教授、王金强研究员和潘利强教授 等人构建了细胞囊泡，其可呈递由抗CD8抗体的单链可变片段和突变蛋白白细胞介素-2（IL2）组成的颗粒酶B反应性融合蛋白（命名为aCD8-GrzBcs-IL2）。其中，aCD8-GrzBcs-IL2旨在同时抑制CD8+T细胞和促进Treg细胞，特别是在CD8+T细胞攻击β细胞时。在体外，这些细胞囊泡可以抑制CD8+T细胞的细胞杀伤作用，增强Treg细胞的扩增。值得注意的是，静脉注射aCD8-GrzBcs-IL2表达的细胞囊泡逆转了77.8%的非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的新发糖尿病，同时没有减少血液中的CD3+T细胞和CD8+T细胞，表明其具有良好的安全性。相关工作以“A Granzyme B-Cleavable T Cell-Targeted Bispecific Cell Vesicle Connector for Reversing New-Onset Type 1 Diabetes”为题发表在 JACS 。

【文章要点】

一、利用aCD8-GrzBcs-IL2融合蛋白构建细胞

虽然已经开发了各种免疫调节剂，包括针对所有T细胞的抗CD3抗体、针对CD8+T细胞的抗CD8抗体、促进Treg细胞发育的白细胞介素-2（IL2）和其他免疫抑制药物。然而，抗CD3和抗CD8抗体主要治疗早期T1D。此外，它们在治疗过程中无意中会破坏T细胞库，导致不可预测的风险，如对感染和细胞因子释放综合征的易感性增加。相反，高剂量的IL2可能导致CD8+T细胞不受控制的增殖，增加对自身免疫性疾病和其他并发症的易感性。有鉴于此，作者在中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）中构建了一种融合蛋白（aCD8-GrzBcs-IL2）。aCD8-GrzBcs-IL2融合蛋白包含抗CD8抗体（YTS 105.18克隆）的单链可变片段（scFv）和IL2的修饰形式（IL2突变蛋白），并且由颗粒酶B可裂解肽连接（图1）。对IL2Rα受体依赖性增加的IL2突变蛋白（24）主要用于刺激Treg细胞的增殖，而抗CD8抗体（YTS 105.18克隆）的scFv用于靶向CD8+T细胞。

图1 表达aCD8-GrzBcs-IL2融合蛋白的工程细胞囊泡

二、细胞囊泡制备

随后，通过超声处理方法作者获得了直径为148.5±3.6 nm的表达aCD8-GrzBcs-IL2的细胞衍生膜囊泡（aCD8-GrgzBcs-IL2 MVs）。IL2突变蛋白已被证实可以选择性地促进Treg细胞在不同部位的增殖，如血液、次级淋巴器官和自身免疫性疾病的非淋巴病变。此外，由于CD8在稳定TCR-MHC I复合物和激活CD8+T细胞的靶细胞杀伤作用方面发挥作用，阻断CD8+T细胞上的CD8可以抑制它们对β细胞的细胞毒性作用，而不会耗尽它们（图2）。

图2 IL2和MVs对T细胞的作用

三、生物学性能

当CD8+T细胞攻击β细胞时，IL2突变蛋白和aCD8之间的可清除颗粒酶B短肽（Ile-Glu-Phe-Asp，IEFD）接头能够控制aCD8的释放，并增强IL2突变素对Treg细胞的暴露，以响应分泌的颗粒酶B。激活后，aCD8-GrzBcs-IL2 MV与CD8+T细胞和Treg细胞的双特异性结合可以激活CD8+T细胞附近的Treg细胞，从而抑制CD8+T细胞的自身免疫反应性。在体外，aCD8-GrzBcs-IL2 MVs可以通过抑制CD8+T细胞的功能和减少CD8+T细胞群来抑制OT-1小鼠来源的CD8+T细胞对表达OVA的B16细胞的杀伤作用。aCD8-GrzBcs-IL2 MVs还可以显著刺激Treg细胞的扩增。在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠中，用aCD8-GrzBcs-IL2 MVs治疗可以通过提高Treg细胞密度和抑制胰腺内的CD8+T细胞来有效逆转新发展的T1D。更重要的是，这种治疗并没有导致接受治疗的小鼠血液中CD8+T细胞的下降（图3）。

图3 MVs对雌性NOD小鼠新发糖尿病的治疗作用

结论与展望

总之，上述研究改造了细胞，使其在细胞膜上表达aCD8-GrzBcs-IL2融合蛋白，并通过超声波破碎和离心获得了细胞膜囊泡，证明了它们在治疗T1D方面的巨大潜力。体外细胞实验表明，aCD8-GrzBcs-IL2 MVs有效地抑制了CD8+T细胞的细胞毒性，而CD8+T细胞是针对胰腺β细胞的自身免疫反应的关键因素。此外，aCD8-GrzBcs-IL2 MVs可以促进Treg细胞的增殖。此外，体内实验强调了aCD8-GrzBcs-IL2 MV在减少活化的CD8+T细胞和恢复胰腺内以及胰腺淋巴结等局部隔室中Treg细胞比例方面的深远影响。aCD8-GrzBcs-IL2 MV、IL2 MV和aCD8-MVs的给药在逆转新发糖尿病方面显示出显著的疗效，aCD8-GrgzBcs-IL2 MV的逆转效率达到77.8%，IL2-MV达到55.6%，aCD8-MV达到44.4%。这些发现强调了这种治疗方法作为治疗T1D的有前景的候选者的潜力。

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