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T细胞疗法在血液恶性肿瘤治疗中展现出显著疗效，但其广泛应用仍面临两大挑战：一是自体细胞疗法的个性化制备流程复杂且成本高昂；二是多重基因编辑过程中产生的异质性细胞群体可能导致疗效不稳定。现有技术如药物筛选或表面标记富集存在效率低、影响细胞活力等问题。此外，多重基因编辑时
非同源末端连接
（
NHEJ
）
常占主导地位，导致部分编辑的细胞混杂，进一步影响产品纯度。因此，亟需开发一种高效、无需药物标记且兼容临床生产流程的细胞富集方法。
近日，加州大学旧金山分校
Justin Eyquem
和
Brian R. Shy
团队在
Nature Biotechnology
上发表了文章
SEED-Selection enables high-efficiency enrichment of primary T cells edited at multiple loci
。
本研究提出了一种名为“合成外显子表达破坏子
（SEED）
”的新型基因编辑策略，通过将外源基因的整合与内源表面蛋白的表达破坏相偶联，结合免疫磁珠负选法实现编辑细胞的精准富集。
SEED模板设计包含以下关键元素：靶向基因内含子的引导RNA
（gRNA）
和携带外源基因的修复模板。当CRISPR-Cas9在靶基因内含子处引入双链断裂后，SEED模板通过同源定向修复
（HDR）
将外源基因插入，同时利用人工剪接信号破坏靶基因的表达。未被编辑或部分编辑的细胞因保留靶蛋白表达，可通过特异性抗体结合磁珠被高效去除。
研究团队针对T细胞疗法的三大关键基因
（TRAC、B2M和CD4）
设计了SEED模板。例如，在TRAC位点插入嵌合抗原受体
（CAR）
时，SEED介导的T细胞受体
（TCR）
表达破坏使编辑细胞无法被抗TCR抗体识别，从而通过负选富集。实验数据显示，单基因编辑后细胞纯度高达98%，三重基因编辑
（如同时敲入CAR、CD47和CD8α/β，敲除TCR、B2M和CD4）
的纯度达90%。此外，通过优化编辑条件（如使用NHEJ抑制剂M3814），双等位基因整合效率提升至83%，显著减少了部分编辑细胞的残留。
为解决转基因TCR与内源TCR链错配导致的非特异性识别问题，研究团队开发了表位编辑策略。通过高通量筛选TCRβ恒定区
（Cβ）
的氨基酸突变，鉴定出可逃逸特定抗体
（如BW242）
结合的突变位点
（如D112K）
。表位编辑后的TCR在保留功能的同时，避免了在富集过程中被误清除，使得正确配对的TCR细胞纯度超过98%。此外，SEED技术成功应用于CD4+ T细胞的共受体改造
（如表达CD8α/β）
，显著提升了MHC-I限制性TCR在CD4+ T细胞中的功能。
总之，
SEED-Selection技术的核心优势在于其“一步法”高效富集能力：无需药物标记、兼容多重编辑，且对细胞活力和基因组稳定性无显著影响。
临床规模实验验证了该技术在符合GMP标准的生产流程中的可行性，单次编辑可获得超过2.5×10
7
个高纯度细胞。基因组稳定性分析显示，SEED-Selection未增加染色体易位或缺失的风险，进一步支持其临床转化潜力。该技术可灵活适配不同靶基因和细胞类型，为开发复杂基因编辑的通用型细胞疗法提供了重要工具，有望推动CAR-T、TCR-T等疗法的标准化生产和疗效提升。
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02531-6
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