在当今生物技术蓬勃发展的时代，微生物细胞工厂在生产药物、化学品、饲料和食品添加剂等领域发挥着举足轻重的作用。构建高性能的微生物细胞工厂，关键在于深入理解和精确调控细胞内的代谢过程。然而，传统的代谢通量分析方法存在局限性，难以实时、动态地监测细胞内的代谢变化，这成为了代谢工程领域的一大技术瓶颈。与此同时，合成生物学的兴起为生物传感器的设计与应用带来了新的机遇和挑战。生物传感器作为感知和响应环境信号的重要元件，在合成生物学中占据着核心地位。而基因线路与动态调控系统的构建，更是合成生物学实现复杂功能的关键所在。
在工业发酵与生物制造领域，葡萄糖作为常用的碳源，其摄取和代谢效率直接关系到目标产物的产量和生产成本。优化发酵过程控制，实现对发酵过程的精细化调控，是提升工业发酵稳定性和可控性的关键。此外，在医药研发领域，许多药物的合成依赖于特定的前体物质，而这些前体物质的生物合成与细胞的代谢过程紧密相连。因此，提高药物前体物质的生物合成效率，对于降低药物研发成本、加速新药研发进程具有重要意义。
中国科学院天津工业生物技术研究所
张大伟和中国工程院外籍院士KAIST李相烨教授等
人
开发出一套可编程的双功能葡萄糖摄取率生物传感器（GURBs），用于实时监测葡萄糖摄取率，并动态激活或抑制大肠杆菌中的葡萄糖摄取和中心代谢。GURBs在不同培养条件下均展现出良好的监测效果，并且在动态调控代谢途径方面也取得了显著成效，为微生物代谢工程和合成生物学领域提供了有力的工具。
相关内容以
“Monitoring and dynamically controlling glucose uptake rate and central metabolism”
为题发表在
《Nature Chemical Engineering》
上。
1.主要内容
图1 GURB的设计原理和验证过程
研究者利用大肠杆菌中Mlc和EIIB的相互作用原理构建GURB，当细胞摄取葡萄糖时，EIIB的变化使Mlc脱离ptsG启动子，解除对GFPmut2表达的抑制，从而监测葡萄糖摄取率。通过构建含ptsG和荧光素酶基因片段的质粒并测量荧光素酶活性，验证了Mlc和PtsG的相互作用。进一步通过截短和突变PptsG，分析不同Mlc结合位点，优化了GURB设计，成功构建了GURB1，并在不同葡萄糖摄取率的菌株中证实了其功能。
图2 构建与优化GURB
研究者将Mlc结合位点整合到人工启动子PAR3655中，通过改变其位置发现不同位置的启动子表达强度差异显著。接着，通过调整Mlc结合位点与+1位置的距离，设计出正向响应葡萄糖摄取率的生物传感器。此外，研究者分析了不同基因启动子的Mlc结合位点，发现结合亲和力不同的Mlc结合位点对GURB响应的影响不同，其中Mlc-manXBS1结合亲和力最低，对葡萄糖摄取率的响应最佳。最后，通过优化Mlc的表达调控，进一步提高了GURB的灵敏度。
图3 GURB在细胞内的实时监测应用
研究者将设计构建的GURB28电路引入不同葡萄糖摄取率的六种菌株中，通过在线荧光监测和离线残糖测量，发现在线荧光增强与离线葡萄糖消耗率之间存在正相关关系，且这种相关性在不同菌株及各个培养阶段均保持有效，证实了GURB作为流量感应系统报告菌株葡萄糖摄取率的原始概念。此外，GURB的正交性也得到了验证，即该生物传感器仅对葡萄糖高度敏感，不受PTS系统中的磷酸供体PEP的影响。
图4 GURB在不同培养条件下对菌株葡萄糖摄取率的监测结果
研究者选取了不同初始葡萄糖浓度、pH值、盐浓度和温度的培养条件，通过在线荧光和离线葡萄糖消耗测量来探究菌株的葡萄糖摄取率。在不同初始葡萄糖浓度下，菌株的葡萄糖摄取率受一定影响，而在不同温度下变化不大，仅在低温时低葡萄糖摄取率菌株的生长受限。然而，在不同pH和盐浓度条件下，葡萄糖摄取率变化显著，pH为7时摄取率最高，盐浓度为0.5%时摄取率最高，过高或过低的盐浓度均会降低摄取率。此外，通过连续培养实验评估了GURB对环境变化的实时监测能力，结果表明GURB能迅速响应培养条件的改变，准确监测葡萄糖摄取率的变化。
图5 利用GURB系统动态调控大肠杆菌中l -色氨酸生物合成
研究者通过构建反馈回路，增强zwf基因表达并抑制ptsG基因表达，实现基于葡萄糖摄取率的动态调控。结果显示，引入反馈回路后的T4DT菌株l -色氨酸产量显著提高，与静态调控菌株相比，在葡萄糖摄取率、产物产量和副产物浓度等方面均具优势。RNA捕获和RT-qPCR分析以及13C标记代谢通量分析进一步证实了GURB系统在代谢调控中的有效性。
