本文主要包括4个Fig,这是典型的Nature风格。Cell Research目前也是国内顶级的生物学类期刊,影响因子最高到了14.8,国内的研究成果发到Cell Research基本上能和国际上的主流期刊媲美。
Fig1:如何发现并确定现象
Fig1中主要是说小分子化合物组合可以直接诱导小鼠成纤维细胞重编程产生自我跳动能力。
Fig1A介绍了整个诱导重编程的流程图,先是把小鼠的成纤维细胞通过两个阶段的不同培养基和化合物的处理,产生了心肌细胞。
Fig1B中小分子化合物组合CRFVPT处理后不同时间点的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)形态变化。
在显微镜中可以观察到,这些细胞类似于心肌细胞的棒状结构,同时具有跳动能力,像心肌细胞一样在那里一张一缩。从这个现象就确定了整个诱导过程是有可能产生心肌细胞的。
Fig1E是在小分子化合物组合CRFVPT处理后14天后的小鼠尾尖成纤维细胞(TTF)形态变化。
这里有个问题,从什么阶段产生这种有跳动能力的细胞呢?作者进行了时间点的观察,发现在第8天就已经产生了有跳动能力的细胞,在5万的细胞中有10多个细胞跳动,到20天就有100个细胞,效率已经很高了。
Fig1D小分子化合物组合CRFVPT的精简,可以发现在去除了CHIR99021、RepSox、Forskolin、VPA后诱导效率就大大的打了折扣。
做了减法后,开始做加法,看看在原来的化合物里增加一些处理能不能提高诱导效率。
Fig1F:在第二阶段中添加不同因子后诱导TTF产生跳动克隆的作用效果
发现加入NRG1、G-CSF两个因子后,可以使细胞产生的效率进一步提高,两者合用效果也会更好。小分子化合物组合CRFVPT联合Rolipram的作用效果(Fig1G)。
然后作者要检测培养出来的是不是真的心肌细胞,在小分子化合物组合处理MEF后24天检测跳动细胞克隆中心肌细胞的标志物,包括Mef2c、Gata4、Nkx2.5、α-MHC、α-actinin、cTnT、cTnI、N-cad和Cx43。
基本上可以确认这个方法可以把小鼠成纤维细胞转变成具有跳动能力的心肌样细胞。
Fig2:对产生的心肌细胞进行完全的鉴定
Fig2A就是对MEFs、MEF-CiCMs (化合物诱导24天后的跳动细胞克隆) 与心肌细胞的基因表达谱进行分析。Fig2B是对表达水平变化大于5倍以上基因的功能分析(GO)。
接下来对心肌细胞特有的第二特征进行鉴定,首先是钙流实验。
Fig2C:MEF-CiCMs(25天)钙流检测;Fig2D:MEF-CiCMs(25天)钙流频率检测;Fig2D:MEF-CiCMs(25天)钙流消退检测。
之后进行电生理检测。
Fig2F:MEF-CiCMs 的电生理检测
Fig2G:免疫荧光技术检测MEF-CiCMs 中MLC2a、MLC2v、α-actinin和HCN4表达
Fig2H:MEF-CiCMs 的电生理检测参数统计
Fig3:谱系示踪法验证
构建Fsp1-Cre:R26RtdTomato背景的遗传示踪小鼠示意图
Fsp1-Cre:R26RtdTomato背景小鼠来源的MEF在小分子化合物组合CRFVPT处理24天后,检测红色荧光(tdTomato)与不同心肌细胞标志物是否共定位。包括:Mef2c、NKX2.5、α-actinin、cTnT、cTnI和α-MHC。
然后又是一套钙流啊,电生理实验,可以证明CiCMs可以诱导小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞。
Fig4:细胞机制的解析
利用Oct4::GFP报告系统,检测化合物诱导重编程过程是否产生iPSCs。可以发现,从1-26天都没有产生阳性信号。
Fig4B用RT-PCR检测不同化合物诱导时间段的心肌祖细胞标志物基因表达水平,包括:Sca-1、Abcg2、Wt1、Flk1和Mesp1。
Fig4C用免疫荧光染色检测Sca-1阳性细胞及其分化为平滑肌细胞和内皮细胞。