首个靶向cGAS的降解剂TH35

环磷酸鸟苷 - 腺苷合成酶（ Cyclic GMP-AMP Synthase ， cGAS ）是一种关键的胞质 DNA 传感器，在胞质 DNA 存在的情况下可启动先天免疫反应 。 cGAS 的过度激活与多种炎症性和自身免疫性疾病密切相关， 其中 包括溃疡性结肠炎（ UC ）。 研究发现， cGAS 在 UC 患者的结肠组织中表达上调，并导致下游炎症信号通路的过度激活。因此，靶向 cGAS 被认为是一种潜在的 UC 治疗策略。然而，目前已报道的 cGAS 抑制剂（ Figure 1 ）普遍存在脱靶效应、药代动力学性质不佳及物种特异性等局限性，限制了其临床应用。近日，清华大学药学院尹航课题组在 Journal of Medicinal Chemistry 上发表了题为 Discovery of a Novel CRBN-Recruiting cGAS PROTAC Degrader for the Treatment of Ulcerative Colitis 的研究论文。该研究报道了首个 CRBN 介导的 cGAS PROTAC 降解剂 TH35 ， 该分子可有效选择性降解 cGAS ，并展现出显著的抗炎作用。 TH35 的发现为 cGAS 介导的炎症性疾病提供了新的治疗策略，并进一步拓展了 PROTAC 技术在自身免疫疾病治疗中的应用前景。

Figure 1. Chemical structures of representative small molecular cGAS inhibitors.

鉴于 G140 是首个表现出对人源和鼠源 cGAS 均具有较强结合能力的 cGAS 抑制剂， 研究人员将其选 为 cGAS PROTAC 的靶蛋白配体，并 基于 cGAS 与 G108 的共晶结构（ PDB ID: 6MJU ） 对 G140 进行了的分子对接研究（ Figure 2A , B ） ，结果显示 G140 的甲基吡唑环和羟基乙酰基均暴露于溶剂中， 表明这些基团可能是适合连接链附着的位点 （ Figure 2B ）。在 E3 连接酶配体的选择上，研究人员选用了 CRBN 配体来那度胺（ Lenalidomide ）和沙利度胺（ Thalidomide ），并系统性地评估了不同长度和化学类型的连接子，最终构建了一系列 cGAS PROTAC 降解剂（ TH1 至 TH42 ）（ Figure 2C ）。通过评估 候选化合物对 cGAS 的 降解活性 以及 对 cGAS 激活 的抑制效果 ， 最终确定 TH35 作为 深入生物学 研究 的先导化合物。

Figure 2. Design of novel cGAS PROTAC degraders based upon cGAS inhibitor G140 and CRBN ligand.

实验结果显示， TH35 在 THP-1 和 RAW 264.7 细胞中均以浓度依赖的方式有效诱导 cGAS 降解（ Figure 3A-D ），并在 THP-1 细胞中表现出时间依赖的降解效果 （ Figure 3E, F ）。基于质谱的无标记定量（ LFQ ）全蛋白组学分析 表明 ， TH35 处理后， cGAS 蛋白水平下降超过 80% ， 而 在 3852 种检测到的蛋白中，仅有 32 种发生显著下调，其中大多数为干扰素诱导蛋白（ Figure 3G ） ， 表明 TH35 能够选择性地降解 cGAS 并抑制 I 型干扰素的应答。 回补实验结果显示， G140 、来那度胺或 MG132 预处理均 可 完全阻断 TH35 诱导的 cGAS 降解（ Figure 3H, I ） ，而 G140 或 阴性对照分子 N-Me-TH35 单独处理 均未观察到 cGAS 降解， 进一步证明 TH35 通过 CRBN 依赖的泛素 - 蛋白酶体通路介导 cGAS 降解 。

Figure 3. TH35 effectively induces cGAS degradation mediated by the ubiquitin − proteasome pathway in a CRBN-dependent manner.

cGAS 能够识别 胞质 中 的 双链 DNA （ dsDNA ） ，激活下游的 STING-TBK1-IRF3 信号级联 反应 ，在自身免疫性疾病的发病机制中起着关键作用。 因此，研究人员进一步 评估 了 TH35 对 cGAS-STING 先天免疫信号 通路 的 调控 作用。定量质谱分析 结果表明 ， TH35 有效降低了 HT-DNA 刺激 下 THP-1 细胞中 cGAMP 的产生 （ Figure 4A ） 。 荧光素酶报告基因 分析进一步 表明， TH35 以 剂量依赖 的方式 抑制 HT-DNA 诱导的 cGAS 信号通路（ Figure 4B, C ）。值得注意的是， TH35 处理并未影响 cGAMP 诱导 的信号 转导 ，这表明 TH35 通过特异性 靶向 cGAS 来抑制 IRF 诱导基因的表达， 而非作用于 cGAS-STING 通路的下游蛋白（ Figure 4D ）。 此外， TH35 以 剂量依赖 的方式 抑制 cGAS-STING 级联信号通路 中 STING 、 TBK 1 和 IRF3 的磷酸化（ Figure 4E, F ）。 RT- qPCR 结果 同样 表明， TH35 以剂量依赖的方式抑制了 HT-DNA 诱导 的 IFNB 和 CXCL10 的 mRNA 表达 水平 （ Figure 4G-J ）。 且 与野生型细胞相比， Trex1 ^−/− RAW 264.7 细胞中 Ifnb mRNA 水平显著上调， 而 TH35 处理 可有效 降低 该细胞中 Ifnb mRNA 水平（ Figure 4 K ），进一步证实 其 对 cGAS-STING 信号 通路的抑制作用。 此外， TH35 未能 降低 cGAMP 诱导的 IFNB 的上调， 再次证明 TH35 对 c GAS 介导的信号转导的特异性 。 （ Figure 4L ） 。 综上所述， TH35 能够选择性地抑制 dsDNA 诱导的 cGAS-STING 信号通路 的激活。

Figure 4. TH35 potently inhibits the activation of cGAS in human and murine cells.

CCK-8 实验结果表明， TH35 在高达 60 μ M 的浓度时对 THP-1 、 RAW 264.7 、 THP1-Lucia ISG 和 RAW-Lucia ISG 细胞均未表现出显著的细胞毒性 （ Figure 5A-D ） ，而 G140 在浓度超过 30 μM 时 就表现出 显著的细胞毒性（ Figure 5E-H ）。这些结果表明，与 cGAS 抑制剂 G140 相比， TH35 具有更有利的体外安全性 和更低的脱靶毒性。

Figure 5. The cytotoxicity of TH35 in human and murine cells.

研究人员进一步探究了 TH35 在 DSS 诱导的 UC 小鼠模型中的治疗潜力，实验设计如图 6A 所示。低剂量和高剂量的 TH35 治疗均显著缓解了 DSS 诱导的小鼠体重减轻，其效果在一定程度上优于 5-ASA （治疗 UC 的一种常见的临床药物）和 G140 （ Figure 6B ），且 TH35 处理组的疾病活动指数（ DAI ）评分（反映体重变化，粪便稠度和便血情况）显著低于 5-ASA 组和 G140 组（ Figure 6C ）。此外，与 DSS 组相比， TH35 处理有效缓解了结肠萎缩和脾脏肿大（ Figure 6D-F ）。组织学检查结果表明， TH35 处理显著改善了结肠病理，促进脾脏形态恢复至接近正常水平，且其组织病理学评分低于 5-ASA 组和 G140 组（ Figure 6G, H ）。综上，与 5-ASA 和 G140 相比， TH35 能有效减轻炎症反应，表现出更优的抗结肠炎作用。

Figure 6. TH35 treatment ameliorates DSS-induced colitis in vivo.

为了进一步阐明 TH35 在 UC 小鼠模型中的抗炎机制，研究人员检测了结肠组织中 cGAS 及其下游信号分子的表达水平。 实验 结果表明， TH35 处理显著降低 了 结肠组织中的 cGAS 蛋白 的表达 ，且呈剂量依赖性下降（ Figure 7A, B ）。相比之下， 5-AS A 处理组 和 G140 处理组的 cGAS 水平变化较小。此外， TH35 处理可有效抑制 cGAS 信号通路下游关键分子的磷酸化，包括 STING 、 TBK1 和 IRF3 ， 并 同样 表现出 剂量依赖性（ Figure 7A, B ）。 RT-qPCR 分析 进一步表明 ， TH35 处理后， 结肠组织中 Ifnb 、 Tnf-α 和 Il-6 的 mRNA 水平 显著下降 （ Figure 7C-E ）。 ELISA 结果进一步证实， TH35 可 显著降低血清中 IL-6 和 TNF-α 的分泌（ Figure 7F, G ）。 尽管 5-ASA 和 G140 同样 抑制 了 这些 下游炎症 因子 的表达 ， TH35 的抑制效果更为显著。 此外， TH35 处理显著降低了 citH3 的表达水平，且相比于 5-ASA 和 G140 ， TH35 处理后的 citH3 水平更接近于对照组水平（ Figure 7H ）。 免疫荧光成像 分析 进一步证实， TH35 处理可有效 抑制 UC 小鼠黏膜 NETs 的 形成（ Figure 7I ）。

Figure 7. TH35 alleviates cGAS-mediated inflammation responses in vivo.

总结：该研究首次报道由 CRBN 介导的 cGAS PROTAC 降解剂 TH35 。与 cGAS 抑制剂 G140 相比， TH35 在阻断人和小鼠细胞中 dsDNA 诱导的 cGAS 激活方面表现出良好的选择性和优越的效力，同时具有较低的毒性。此外，在 DSS 诱导的 UC 小鼠模型中， TH35 表现出比 G140 更强的抗炎作用。总体而言，这项工作展现了 cGAS PROTAC 的治疗潜力，并为开发治疗 UC 的新型抗炎药物提供了一个很有前途的先导化合物。

本文作者：LT

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