李金明等：我国肿瘤基因突变NGS检测的规范化路径探讨

自2005年基于焦磷酸测序原理的Genome Sequencer 20测序系统出现以来，经过近20年的发展，高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术日趋成熟，在无创产前筛查、肿瘤治疗、遗传病、罕见病以及感染性疾病诊断等领域均具有重要的应用价值 ^［1］ 。其中，精准肿瘤学领域研究进展迅速，大量的靶向和免疫治疗药物持续研发和上市，同时药物相关的基因突变位点也在临床研究中不断被发现 ^［2］ 。但是，由于NGS方法学的特殊性以及肿瘤靶向和免疫治疗基因突变位点的持续更新，肿瘤基因突变NGS检测临床应用如何应对这种日新月异的更新，保证检测结果的临床有用性，是一个需要深入讨论并明确的重要问题。本文将结合NGS技术、肿瘤基因突变的特点以及国内外目前肿瘤基因突变NGS检测规范化应用的现状，探讨我国肿瘤基因突变NGS检测的规范化路径。

NGS技术可实现从单一或少量标志物的检测，进入到同时对几百、上千甚至更多基因检测的新模式，具有划时代的意义。以美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的肿瘤基因突变NGS试剂［通常为实验室自建检测（laboratory-developed tests，LDTs）模式］为例，OncomineDx Target Test、FoundationOneCDx、MSK-IMPACT、Omics Core、PGDxelio tissue complete、NYU Langone Genome PACT、ACTOnco IVD和xT CDx等8种NGS试剂所检测的基因数量分别为23、324、468、468、505、607、440和648个 ^［3］ 。如果涉及肿瘤免疫治疗疗效预测标志物，如肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），则需要同时分析多达数百个肿瘤相关基因或位点 ^［4］ 。

从方法原理来说，肿瘤基因突变NGS检测通常采用靶向探针捕获或引物特异性扩增的方法实现对特定基因的靶向测序，然后通过生物信息学分析识别突变 ^［5］ 。因此，其检测策略为先对靶向区域全部测序，然后分析该区域内的目标位点，即“捕鱼”模式。换言之，NGS方法的测序区域与检测范围是不同的，检测范围是测序区域中临床意义明确且经过分析性能确认的突变或位点，是测序区域的一部分。而大部分传统的分子检测方法，如实时荧光PCR，通过对特定的基因突变或位点设计特异性的引物探针实现检测，即“钓鱼”模式 ^［6］ 。例如，某试剂检测EGFR L858R和T790M突变，则需要分别建立靶向两种位点的体系，靶向位点同时也是检测范围。因此，肿瘤基因突变NGS方法对于临床检测来说，不仅是方法原理的创新，同时也是检测理念的变革。

精准肿瘤学是精准医学最重要的组成部分，2015年初发布的美国精准医学计划主要有两个目标，近期目标为更多更好的癌症治疗，远期目标为获得可用于整个健康和疾病领域的知识 ^［7］ 。精准肿瘤学中最重要且进展最快的是肿瘤靶向和免疫治疗。目前美国FDA已批准超过80种针对肿瘤基因突变的靶向治疗药物和免疫治疗药物，覆盖30多种癌症类型，其中非小细胞肺癌相关的靶向和免疫治疗药物近30种 ^［8］ 。由于选择药物治疗人群对保证靶向和免疫治疗疗效的重要性，药物相关基因突变的检测对于肿瘤精准治疗极为关键。

肿瘤基因突变标志物最重要的特点是其总在不断更新，而不是固定不变的。随着治疗药物的研发和获批，以及临床研究的进展，肿瘤基因突变标志物不断增加。以非小细胞肺癌为例，自2011年美国FDA批准克唑替尼（crizotinib）用于ALK基因融合阳性的局部晚期或转移性患者靶向治疗以来，各种批准的治疗药物伴随诊断相关的基因已有11种，包括ALK、EGFR、ROS1、BRAF、MET、KRAS、RET、NTRK1/2/3和ERBB2 ^［8］ 。同一基因的突变位点也在不断增加，以EGFR基因为例，美国FDA最初批准19外显子缺失及21外显子的L868R突变作为指导非小细胞肺癌靶向治疗用药的伴随诊断位点，随后又增加了18、20和21外显子上的其他位点，包括T790M、S768I、L861Q、G719X及20外显子插入突变。随着药物的研发及其与肿瘤基因突变关系的研究进展，肿瘤治疗的临床指南也在不断快速更新，截至2023年12月，美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）推荐的各种类型癌症相关的靶向治疗药物涉及的基因超过50种。对于肿瘤免疫治疗，2017年美国FDA批准了帕博利珠单抗（pembrolizumab）用于所有高微卫星不稳定性（MSI high，MSI-H）不可切除的或转移性实体肿瘤患者，且成人或者儿童均可使用，这是美国FDA首次按基因标志物而非肿瘤类型来批准的抗肿瘤药物，即药物选择与肿瘤类型或组织来源无关，而是以标志物为依据 ^［9］ 。2019年非小细胞肺癌NCCN指南中，TMB为免疫检查点抑制剂治疗的预测标志物。2020年美国FDA批准了帕博利珠单抗治疗TMB-H不可切除的或转移性实体肿瘤患者，TMB是肿瘤免疫治疗的第二个泛癌肿伴随诊断标志物，FoundationOneCDx作为检测TMB的伴随诊断方法 ^［10］ 。总的来说，肿瘤靶向和免疫治疗基因突变标志物的基因、突变位点和适用肿瘤类型均随着研究进展在不断扩展。

我国高通量测序检测实验室的规范化历经了近10年的时间。2014年国家食品药品监督管理总局（现国家药品监督管理局）办公厅、国家卫生计生委办公厅发布了《关于加强临床使用基因测序相关产品和技术管理的通知》，之后批准了一系列胎儿染色体非整倍体游离DNA检测的体外诊断产品，发布了实验室检测规范要求 ^［11-12］ 。但是肿瘤、遗传病和病原体宏基因组测序在临床实验室检测的规范化应用仍面临着巨大的挑战 ^［13-14］ 。

新技术、新标志物的不断出现，特别是其变化很快时，在临床应用中有潜在带来医疗风险的可能，而实验室检测规范化的目的就是评估并有效控制医疗风险。对于肿瘤基因突变NGS检测，我国国家药品监督管理局目前已批准18种肿瘤诊疗相关的基于NGS方法的体外诊断试剂，除用于非小细胞肺癌组织的TMB检测试剂盒外，其他产品检测基因数量为2~10个，基本针对单一癌肿，如出现新的临床意义明确的肿瘤治疗基因突变标志物，需要注册新的体外诊断试剂，上述方式远远不能满足临床需求。2021年，国务院发布了《医疗器械监督管理条例》，明确规定“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下，在本单位内使用” ^［15］ 。该条例的发布标志着我国LDTs临床应用的开始，但是对于肿瘤基因突变NGS检测，LDTs如何区别于体外诊断试剂，最大程度满足肿瘤临床诊疗需求且有效控制风险尚不明确。

检测方法的准确性是实验室开展肿瘤基因突变NGS检测的前提条件，无论是体外诊断产品，还是LDTs，均需要满足两个要求，即意义明确和方法可靠。由于肿瘤基因突变标志物是不断扩展的，如保证新的位点能快速应用于临床，则必须建立新增位点的临床意义和分析性能确认的规范化流程。最核心的问题是，新增位点是基于一个新的NGS检测方法，还是基于原有检测方法的基础上进行增补？这与肿瘤基因突变NGS检测方法的特点紧密相关，即方法的检测范围仅是测序区域的其中一部分，因此肿瘤基因突变NGS检测可在一个固定检测系统下，根据标志物临床证据等级的变化，在增加补充新位点分析性能确认结果的基础上，进行检测范围动态扩展。具体包括以下两个关键方面。

1.根据标志物临床证据等级变化调整检测范围： 美国FDA器械和放射卫生中心（Center for Devices and Radiological Health，CDRH）依据临床证据的可靠程度将基因突变分为三级：一是具有明确伴随诊断意义，即包括FDA所批准的靶向治疗药物伴随诊断位点，预期用途为指导用药；二是具有显著临床意义，包括临床指南明确提出具有临床意义的突变位点，预期用途是为专业医护人员提供药物治疗或耐药相关的信息；三是具有潜在临床意义，预期用途是为加入临床试验的受试对象提供参考，以判断是否适合相应的临床试验 ^［16］ 。由于肿瘤基因突变标志物随着新的治疗药物的研发而不断更新，FDA明确了在原有分级标准的基础上，可以根据证据等级的改变调整位点的报告范围，以及时满足临床需求。例如，对于伴随诊断位点，FoundationOneCDx在2017年被批准用于18种靶向治疗药物的伴随诊断后，先后进行了19次增补的上市前审批（premarket approval，PMA），以增加其预期用途，第一级位点已从8种肿瘤靶向治疗相关基因增加至目前的32种 ^［17］ 。这是基于新增伴随诊断证据基础上，如FoundationOneCDx新增RET基因融合的伴随诊断位点基于利用LIBRETTO-001临床试验剩余样本进行桥接试验提供临床有效性的证据 ^［18］ 。对于临床指南的更新，美国CDRH认为，在新增位点分析性能确认符合要求的情况下，可调整突变位点的报告等级 ^［16］ 。如纪念斯隆凯特琳癌症研究中心（Memorial Sloan KetteringCancer Center，MSK）的IMPACT试剂，其配套了基于分级标准和证据等级的OncoKB数据库，并根据临床指南更新不同突变的临床意义等级，同时报告范围也相应改变。需要指出的是，当临床指南等证据等级更新时，实验室可根据临床需求以及实验室具体情况来决定是否调整检测范围。

2.根据新位点补充分析性能确认结果： 当根据标志物临床证据等级变化，在原有NGS方法测序区域内，增加新位点的检测范围时，还需要确认新增位点分析性能符合要求。关于NGS检测分析性能的确认，目前公认的原则为实验室优先对临床意义明确的位点、代表性突变类型和复杂区域位点等进行性能确认 ^［19］ 。对于检测范围中新增位点，美国分子病理学家协会（Association for Molecular Pathology，AMP）及美国病理学会（College of American Pathologists，CAP）等发布的NGS性能确认指南中明确了分析性能确认是对原固定检测系统已完成的分析性能确认结果的补充，而无需对原检测系统重新进行完整的性能确认 ^［20］ 。即当新增位点在一个固定检测系统下原有的测序区域内时，对新增位点的性能确认，是对原固定检测系统已完成的分析性能确认结果的补充。如FDA于2023年第18次更新了FoundationOneCDx的伴随诊断位点，补充批准该试剂用于指导塞尔帕替尼（selpercatinib）治疗RET基因融合阳性的实体瘤患者，该批准基于对FoundationOneCDx检测RET基因融合补充的分析性能确认数据，包括使用20种肿瘤类型的临床样本开展的检测准确性、敏感性和精密度结果 ^［18］ 。新增位点的分析性能确认方案设计可参考原检测系统的性能确认方案进行，样本类型、肿瘤类型等应与新增位点的临床预期用途相符。

利益冲突

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