mRNA翻译过程中，核糖体沿着mRNA滑动，读取mRNA序列并合成相应的多肽链。单个密码子的翻译包括多个步骤，即解码
（将同源氨基酰基tRNA传递到核糖体A位点）
，将生长的肽链从P位点肽基-tRNA转移到A位点氨基酰基-tRNA
（这是一种由核糖体肽基转移酶中心催化的反应）
，最后是易位。在此过程中，mRNA相对于核糖体移动一个密码子。虽然经典的翻译延伸循环已经得到相对较好的解析，但核糖体经常遇到难以翻译的序列，这些序列会改变翻译延伸动力学。这些序列包括程序化翻译暂停位点
（如促进共翻译蛋白折叠或靶向细胞器的序列）
以及RNA结构、核苷酸修饰甚至RNA损伤。核糖体如何解决这些障碍尚不清楚。
目前对核糖体易位的大部分知识来自于生化和结构的研究，在这些研究中，通常对单个核糖体的行为进行评估。然而，体内mRNA分子通常以多聚核糖体的形式同时被多个核糖体翻译。多聚体内的不同核糖体可以经历不同类型的功能相互作用，例如，如果核糖体在有问题的序列上停滞，尾随的核糖体可能会与停滞的核糖体碰撞。这种碰撞的“异构体”将领先的核糖体标记为有缺陷，导致其被细胞质量控制通路去除
【1】
。此外，如果细胞碰撞的核糖体数量很高，就会引发全细胞的应激反应
【2】
。虽然核糖体碰撞主要是在停滞核糖体的背景下进行研究的，但尚不清楚密集多聚体内的两个易位核糖体之间是否也会发生
（瞬时）
碰撞，如果是这样，这种瞬时碰撞对翻译延长的影响是什么。
近日，来自荷兰乌得勒支大学医学中心的
Marvin E. Tanenbaum
团队在
Cell
杂志上发表了文章
Long-term imaging of individual ribosomes reveals ribosome cooperativity in mRNA translation
，
开发了具有强大的单核糖体分辨率的活细胞单分子成像技术，以监测单个核糖体在单体或多聚体中的翻译。
通过实验和模拟发现，
翻译核糖体经常发生短暂的碰撞。
然而，与持续碰撞不同，瞬态碰撞逃脱了细胞质量控制通路的检测。相反，这种短暂的核糖体碰撞通过减少核糖体在有问题序列上的停顿来促进生产性翻译，称之为核糖体协同性。核糖体协同作用还通过质量控制通路减少核糖体的再循环，从而增强翻译。总之，
这种单核糖体成像方法表明，核糖体在翻译过程中相互配合，以确保快速有效的翻译。
为了开发能够在活细胞中具有单个核糖体分辨率的成像技术，研究人员产生了缺乏框架终止密码子的环状RNA——socRNAs，可由一个或多个核糖体翻译数小时。socRNAs允许非常精确地测量翻译延长动力学，并能够比较单个或多个核糖体同时翻译相同mRNA序列的情况。socRNAs是通过Tornado系统在细胞中产生的，翻译过程可以使用SunTag翻译成像系统进行可视化。SunTag系统是利用单链可变区片段抗体
(Single-chain variable fragment , scFv)
的轻链和重链的表位结合区域融合形成一个单独的多肽，并且这种多肽以溶解的形式表达在细胞里面，而不像一般的抗体在细胞中不能正确地折叠。scFv抗体可以结合到串联的多肽表位上，与scFv抗体融合的GFP让整个系统可视化，从而达到放大细胞中蛋白质信号的作用。为了增强单个socRNAs的成像和跟踪，研究人员通过编码socRNA序列中的第二表位标签ALFA-tag，并将同源ALFA标签纳米抗体
（ALFANb）
靶向质膜，将socRNA连接到质膜上。最后，使用多西环素诱导型启动子来调节socRNA的表达。将socRNAs引入表达SunTag抗体
（STAb）
-GFP和膜锚定ALFANb的人U2OS细胞中，并通过旋转圆盘共聚焦显微镜成像。socRNA表达细胞的延时成像显示GFP焦点随时间强度增加，且这些GFP焦点代表了与翻译的socRNAs相关的新生多肽。利用翻译抑制剂puromycin处理，发现单个socRNAs可被1-4个核糖体翻译，且socRNA上的所有核糖体同时
（在几分钟内）
开始翻译，并且在以后的时间点没有额外的核糖体加载到socRNA中。
socRNAs不仅可作为一种强大而可靠的检测方法来可视化单个或多个核糖体的翻译，而且可用于精确测量核糖体易位动力学。通过分析成像，发现翻译的平均延长率为2.6个密码子/秒，与之前对同一细胞中线性mRNAs的测量结果非常相似，同时发现socRNAs的膜束缚对延长率没有可检测到的影响。将已知的暂停序列引入socRNA，证实socRNA能准确地概括了这些序列上的暂停，并允许非常精确地量化暂停持续时间。除了测量翻译延长率外，socRNA测定还独特地给出了核糖体加工性的测量值
（定义为核糖体终止翻译前翻译的密码子总数，约70000个）
，这是一个使用传统测定难以获得的参数。总之，这些结果表明，
socRNAs可以精确测量翻译延伸动力学，因此为研究翻译延伸阶段提供了一个强大的工具。
利用socRNAs的成像技术对单个核糖体的翻译延伸速率进行分析，发现不同的核糖体具有不同的翻译速率。这种翻译速率的异质性并不是由于观察技术的噪声、表达STAb-GFP的细胞之间有差异、socRNAs的序列差异性等造成的，而是内在的核糖体异质性导致的。这种延伸速率的异质性就会导致翻译相同socRNA的不同核糖体会在翻译过程中可能会发生频繁的碰撞。模拟研究显示，翻译核糖体之间的碰撞经常发生在socRNAs和线性mRNAs上。那么碰撞是否诱导核糖体的再循环，降低翻译效率？答案是否定的，瞬时的核糖体碰撞逃脱了细胞质量控制通路的检测，没有诱导核糖体再循环，相反这种短暂的核糖体碰撞通过减少核糖体在正常mRNA序列上的随机停顿来促进生产性翻译，称之为核糖体协同性。机制上，碰撞持续时间和队列长度共同决定了核糖体回收效率。因为与两个易位核糖体之间的碰撞相比，停滞的核糖体引起的碰撞会导致更长的持续时间和队列长度，这些发现为生理和病理碰撞之间的有效区分提供了一个合理的解释。此外，核糖体协同作用还通过质量控制通路减少核糖体的再循环，从而增强翻译。
总的来说，
这项研究开发了一种强大的单核糖体分辨率的活细胞单分子成像技术，可用于研究单个核糖体在单体或多聚体中的翻译过程。同时揭示了翻译过程中经常发生的核糖体瞬时碰撞现象，这种生理性碰撞即为核糖体的协同作用，促进生产性翻译。这也解释了在真核翻译过程中通常观察到的mRNA上的高核糖体负载可能通过核糖协同作用提高翻译效率。
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00045-5
制版人：十一
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Cell
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4–416.e14. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.006.
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