用于冷冻干燥的配方设计：蛋白稳定的案例研究

摘要:配方设计是用于注射途径给药剂型的药品产品开发的组成部分。特别是对于冷冻干燥配方，辅料的选择至关重要，直接关系到冷冻干燥循环性能和最终产品质量。本章聚焦于冷冻干燥蛋白配方的开发，例如单克隆抗体配方。疫苗、寡核苷酸以及基因和细胞治疗产品不在本章讨论范围内。总结了用于注射冷冻干燥生物制药的典型辅料及其功能，并提供了近期商业配方的示例。讨论了在冷冻和解冻过程中的稳定机制、固态中的分子动力学、关键质量属性以及产品属性与冷冻干燥循环性能之间的联系，并在案例研究中举例说明了依赖配方参数的冷冻干燥一般规则。

1.辅料选择

辅料是配方中非治疗活性成分，用于在配方基质中稳定蛋白质。辅料的选择至关重要，因为它直接影响最终药品产品的关键质量属性。辅料需要无毒性、无免疫原性，并在应用的临床剂量下安全。辅料必须获得预期给药途径的批准，并符合药典要求。这尤其适用于通常通过注射途径给药的生物制药，这限制了辅料的选择。此外，辅料应在制造、运输和药品产品的整个保质期内稳定，理想情况下应易于处理 。

1.1.辅料的作用

表 1 提供了近期单克隆抗体冷冻干燥配方中通常使用的辅料概览，包括它们的功能、具体示例和注意事项。可以在 Constantino 和 Pikal发布的生物制药产品辅料小手册中找到更多示例。

一般来说，辅料的作用包括蛋白质稳定、产品可制造性（填充剂、降低粘度剂）、确保人类耐受性（缓冲系统、等渗剂）、确保正确和安全的药物给药，以及提供使用中的稳定性（防腐剂、加速重构、表面活性剂、降低粘度剂）。重要的是，辅料可能同时执行多个功能。特别是对于冷冻干燥配方，辅料的选择也与冷冻干燥过程性能相关，如下节所述。配方的定量组成，例如总固体含量或蛋白质与糖的比例，结合填充体积，显著影响冷冻干燥蛋糕的阻力和最终冷冻干燥过程性能以及产生的关键质量属性，如蛋糕外观、残留水分和重构时间。

1.1.1.蛋白质稳定

对于冷冻干燥配方，辅料首先需要在冷冻干燥前稳定溶液中的蛋白质，然后在冷冻干燥过程中，最后在药物产品运输和干燥状态下的储存期间稳定蛋白质。缓冲液用于防止显著的 pH 变化，否则可能会破坏蛋白质折叠，从而影响生物活性。蛋白质配方通常在它们的等电点远离几个 pH 单位处制备，以避免基于电排斥的蛋白质聚集。在许多情况下，pH 的选择是在物理和化学稳定性之间以及在配方开发活动中筛选的，连同生理耐受性，如下文进一步概述。对于单克隆抗体，典型配方的 pH 值在 5 到 7 之间。此外，对于冷冻干燥配方，缓冲系统在冷冻过程中不应结晶，从而失去功能，如磷酸盐或琥珀酸盐缓冲液的情况。表面活性剂是两亲分子，是蛋白质配方的重要组成部分。它们通过优先占据相同的竞争位点来保护蛋白质免受各种类型的界面应力，从而保护蛋白质。表面活性剂防止蛋白质在液体状态下的填充完成过程中吸附，例如吸附到无菌过滤器或管道上，并保护在液体-空气界面上的扰动。在冷冻和干燥过程以及随后的储存期间，表面活性剂对冷冻干燥配方的相关性较小，因此可以比等效液体配方使用更低的浓度。对于注射剂型，只有少数批准的表面活性剂（例如，聚山梨酯 20、聚山梨酯 80、solutol 和泊洛沙姆 188）。它们各自都有其特定的挑战。聚山梨酯容易发生氧化和水解降解，后者可能是由酶引起的，这些酶是药物物质制造过程中的残留宿主细胞蛋白，泊洛沙姆可能会与蛋白质聚集体和硅胶形成可见颗粒，正如最近报道的那样。由于这些是长期事件，通常发生在液体状态下的产品保质期内，因此表面活性剂降解对冷冻干燥配方的相关性较小。然而，在进一步稀释产品到输液袋中时，表面活性剂在药物给药期间很重要，以防止蛋白质吸附；下面将进一步阐述这种情况。与冷冻干燥配方相比，氧化事件在液体溶液中加速。尽管如此，为了保护蛋白质免受氧化应激，包括在填充完成过程中由于制造区域的消毒周期中可能残留的过氧化氢，可以向配方中添加抗氧化剂，如蛋氨酸。抗氧化剂也可以添加以保护其他辅料免受氧化。在冷冻干燥配方中，辅料需要在冷冻和干燥过程中稳定蛋白质。虽然冷冻浓缩到最大冷冻浓缩液导致分子拥挤和通过产生新的冰/配方界面的界面应力，干燥步骤通过升华和脱附冰层或剩余吸附水对蛋白质造成压力。特别是，水/冰分子与蛋白质之间的氢键的破坏可能导致蛋白质展开。过去几十年中为蛋白质稳定建立的最常见辅料是糖，如蔗糖和海藻糖。这些辅料被认为通过优先排除、玻璃化和水替代来稳定蛋白质，如下节进一步阐述。由于它们能够糖化蛋白质，因此不鼓励使用还原糖。辅料影响最大冷冻浓缩液的玻璃化转变温度（Tg'）、冷冻干燥循环中的塌陷温度（Tc）以及冷冻干燥后产品的玻璃化转变温度（Tg），因此也从加工角度来看也很重要。Tg' 和 Tc 有助于优化冷冻干燥循环时间，在保持冷冻干燥蛋糕完整性的同时获得短的冷冻干燥循环。Tg 与产品储存温度相关，如下节 3 更详细地概述。尽管海藻糖在 Tg'/Tg 方面优于蔗糖，但由于其在冷冻状态下辅料结晶的潜力，例如在药物物质储存期间，带来了挑战。为了进一步减少冷冻干燥循环时间，并在保持蛋白质稳定性和优雅蛋糕外观的同时允许更高的产品储存温度，探索了如 2-羟丙基-β-环糊精、聚维酮或与蔗糖等冷冻/干燥保护剂混合的葡聚糖等辅料，以提高玻璃化转变和塌陷温度（在表 1 中称为塌陷温度修饰剂）。尽管葡聚糖在保持蛋糕外观方面是一个有前景的辅料，但已证明它会导致蛋白质糖化，特别是在升高温度下储存时。

1.1.2.可制造性

冷冻和干燥保护剂以足够高的浓度使用，以在产生完整的冷冻干燥蛋糕的同时稳定蛋白质。然而，在药物负荷低的情况下，可能需要填充剂来生产优雅的产品。填充剂可以是蔗糖或海藻糖等糖，但由于有利的工艺性能，可能更倾向于其他辅料。例如，经常使用甘露醇，它产生优雅的蛋糕并能够快速和容易的冷冻干燥循环。然而，甘露醇的冷冻干燥可能导致包括无定形和结晶形式在内的不同多晶型，后者影响蛋白质稳定性。因此，建议在使用基于甘露醇的配方时进行退火步骤，以允许一种转化为另一种。此外，最近表明，高填充体积、快速冷冻速率和高甘露醇浓度依赖于基于甘露醇的配方的目标冷冻温度可能导致小瓶破裂，这可以通过工艺参数优化来避免，例如退火。对于高浓度蛋白质配方，可能需要添加降低粘度剂以避免在无菌过滤、填充或随后的药物给药过程中遇到挑战，但也由于增加的粘性流动和蛋糕阻力而在冷冻干燥过程中遇到挑战。高粘度是由分子拥挤产生的，特别是由非共价蛋白质-蛋白质相互作用产生的。这些通常在中等蛋白质浓度（例如，约 50 mg/mL）时由长期的、在许多情况下是静电相互作用主导，过渡到在更高蛋白质浓度（例如，约 200 mg/mL）时短期相互作用，如疏水相互作用占主导。前者可以通过添加不同的反离子来筛选，后者可以通过添加氨基酸来筛选。已证明精氨酸盐和衍生物最为有效。

1.1.3.耐受性

注射产品通常配制成等渗渗透压和等水性pH值，以在患者中获得最佳耐受性。耐受性，包括注射时的疼痛，取决于给药途径，Roethlisberger及其同事最近回顾了相关豁免情况。如上所述，等水性条件由缓冲系统调整，与物理和化学稳定性相妥协。为了维持酸碱平衡，由于血液的自我缓冲能力，对于较大体积的静脉输液配方，缓冲系统被放弃。可以通过不同的辅料获得等渗性。然而，在许多情况下，它们是基于一个或多个额外功能而被选中的。特别是对于冷冻干燥配方，冷冻和干燥保护剂或填充剂因此有资格作为等渗剂。

1.1.4.药物给药

由于微生物生长的考虑，注射产品通常作为单剂量剂型供应。然而，如果通过添加防腐剂、初级包装容器的设计，或立即由预期使用者使用来防止从初级包装容器多次抽取时的潜在微生物污染，药物产品也可以作为多剂量小瓶供应。冷冻干燥产品的准备包括在无菌条件下重构产品，随后直接注射或进一步稀释到输液袋中。重构时间应快速，即立即或在几分钟内，因此对最终用户来说很方便，理想情况下无需额外设备。如果在实现快速重构时间方面遇到挑战，建议对蛋糕结构进行初步彻底表征，并密切审视冷冻干燥过程参数和循环性能。此外，通过降低冷冻干燥后的顶空压力可以加速重构。如有必要，可以通过添加辅料如叔丁醇进一步加快重构。在注射时，重构的配方需要能够通过通常的25-27G（皮下）或31G（眼部）针头进行注射，这可能需要上述的降低粘度剂。在输液过程中防止蛋白质吸附到给药材料上，添加表面活性剂是必不可少的。

1.2.商业冷冻干燥药品产品的示例

为了举例说明上述辅料的选择及其作用，表2提供了一个非穷尽的本章范围内的冷冻干燥生物制药的上市配方列表。Constantino和Pikal之前发布的出版物中可以找到包括单克隆抗体以外的生物分子和2004年之前的全部注射、冷冻干燥产品的完整列表。特别是，表2中突出了配方成分，为表1中列出的辅料提供示例。此外，还总结了首批进入欧洲和美国市场的两种参考产品，Herceptin®和Remicade®的生物类似药的配方。

表2显示，大多数商业抗体基配方包含组氨酸或磷酸盐缓冲液，pH值在5.0到7.2之间，结合蔗糖或海藻糖作为冷冻/干燥保护剂/等渗剂，以及聚山梨酯作为稳定剂。一些配方由甘露醇、甘氨酸或葡聚糖作为填充剂组成。有趣的是，相同参考产品的生物类似药配方并不相同，例如，在英夫利昔单抗生物类似药Zessly®和Ixifi®的情况下包括了如山梨醇和甘氨酸等稳定剂。

2.蛋白质的工艺和储存稳定性：在冷冻、干燥和储存期间的稳定

2.1.理论考虑

蛋白质在冷冻干燥和随后干燥状态下的稳定机制通常可以通过以下三个概念来描述：

• 水替代理论描述了蛋白质原生结构的热力学稳定。根据这一理论，辅料与蛋白质相互作用形成氢键，从而作为在干燥过程中被移除的水分子的替代品。需要辅料在蛋白质表面形成单层，以在所有氢键位点替代水，从而充分稳定蛋白质。通常需要辅料与蛋白质的最小摩尔比为360:1，以确保冷冻干燥产品中蛋白质的稳定性。

• 玻璃动力学和玻璃化理论描述了动力学稳定，其中蛋白质被固定在无定形辅料的玻璃基质中。玻璃化被认为有助于蛋白质在冷冻和干燥过程中的稳定性，以及在干燥状态下的储存。更精确地说，这一机制描述了通过增加粘度（在冷冻过程中通过冷冻浓缩和温度降低，在干燥过程中通过水的移除）来降低流动性，从而减缓动态降解过程。由于增加粘度导致的这种固定与玻璃转变有关，对于最大冷冻浓缩溶液称为Tg'。在干燥状态下的玻璃转变温度称为Tg，代表整体流动性（α松弛或慢运动）。最近，多项研究进一步证实了局部流动性（β松弛或快运动）在固态中的重要性。关于局部和整体流动性与干燥状态下蛋白质稳定性的作用将在下面的3.5节中更详细地讨论。

• Timasheff等人发展的优先排除理论描述了蛋白质的热力学稳定，其中溶质从蛋白质表面被排除，从而使蛋白质优先保持在其水合形式。虽然这一机制主要描述了在液态中通过共溶剂稳定蛋白质，但它也对在冷冻步骤开始时的蛋白质稳定性有所贡献，当时溶液尚未玻璃化。

2.2.实际考虑

玻璃化和水替代理论都与干燥状态下蛋白质的稳定性有关。这两个理论的极端重要性已在Tonnis等人的研究中得到证实。他们研究了一种用不同类型的糖冷冻干燥的抗体：二糖海藻糖、4 kDa的菊粉作为灵活的寡糖，以及不同分子量的葡聚糖。所有配方都在60°C下储存，这远低于它们的玻璃转变温度（Tg），因此通过玻璃化来稳定。尽管如此，在配方中观察到了稳定性差异，这不能通过玻璃化来解释。每种辅料都有羟基，因此预期通过水替代来稳定。这项研究表明，仅玻璃化不足以确保蛋白质的稳定性。此外，该研究进一步完善了水替代理论，强调了立体障碍的重要性。辅料的立体属性是确定糖是否能够通过水替代来稳定的一个重要参数。Tonnis等人发现，与缺乏在蛋白质表面形成紧密单层能力的刚性糖相比，灵活的糖是更好的稳定剂。随着糖分子大小的增加，关于蛋白质相互作用的立体障碍的相关性变得越来越重要。最后，Tonnis等人的研究表明，蛋白质稳定性是由水替代而不是玻璃化来决定的。这与文献一致，文献指出，在比玻璃转变温度低10-20°C的储存温度下，蛋白质稳定性是由玻璃化决定的，而在远低于Tg的温度下，水替代是主要机制。水替代、立体障碍和玻璃化之间的这种相互作用进一步通过图1中所示的数据得到证明。当用二糖蔗糖或灵活的寡糖2-羟丙基-β-环糊精（HPβCD）在摩尔蛋白质与糖比例分别为1:3485和1:794的情况下冷冻干燥一种抗体时，抗体配方得到了很好的稳定。相比之下，当用刚性多糖葡聚糖500 kDa在摩尔比为1:3068（基于葡萄糖单元计算）的情况下配方时，观察到了可溶性聚集体的增加，表明立体障碍的影响。然而，当使用葡聚糖500 kDa和蔗糖的混合物时，小的二糖（摩尔蔗糖与蛋白质比例>360:1）能够通过氢键与蛋白质紧密相互作用，而葡聚糖可以通过玻璃化来稳定。在40°C储存9个月后的稳定性数据显示了玻璃化的重要性。蔗糖配方的Tg约为43°C（残留水分约为4%），而HPβCD配方的Tg约为200°C。因此，当在40°C储存时，蔗糖配方中的抗体没有得到充分固定，显示出高度聚集，而HPβCD配方在远低于其Tg的条件下储存，观察到的聚集要少得多。

2.3.辅料属性及其对冷冻干燥过程的相关性

冷冻干燥是一种成本高且耗时的药品产品制造过程。因此，一个最优的冷冻干燥开发过程旨在开发短的冷冻干燥循环，在确保蛋白质稳定性的同时，制造出优雅的冷冻干燥物。要做到这一点，一个先决条件是对配方的Tg'的知识，这是设计冷冻干燥过程的一个重要特征。

2.3.1.辅料属性的分析

Tg'通常使用差示扫描量热法（DSC）确定，通过在冷却和加热循环期间对样品和参考皿的热容进行比较测量。与其他吸热（例如，熔化）或放热（例如，结晶）事件不同，玻璃转变不是一个相变，而是一个动力学现象，可以检测为基线上的一个台阶，由于热容的变化。一般来说，加热或冷却速率越高，在DSC测量中检测软台阶的灵敏度越高。然而，更快的速率涉及台阶的展宽，并且通常将玻璃转变温度向更高温度移动。因此，首先在较高速率（例如，5°C/min或10°C/min）进行筛选，然后在较低的加热和冷却速率（例如，1-3°C/min）下进行第二次运行，以准确确定Tg'，可能会有所帮助。对于冷冻干燥过程开发，除了DSC测量外，通常还使用冷冻干燥显微镜来确定配方的塌陷温度（Tc）。

如上所述，DSC还可以确定结晶事件，如共晶温度（Teu），在甘露醇等结晶填充剂的情况下变得重要。冷冻干燥后，当使用甘露醇等结晶辅料时，可能需要X射线粉末衍射（XRPD）作为额外的技术来表征冷冻干燥物的形态，这也可以使用XRPD确定可以形成不同多晶型的结晶辅料。

结晶辅料通常被用来克服蔗糖或海藻糖基配方的低玻璃转变温度相关的挑战，特别是对于低浓度蛋白质配方，但确实增加了额外的复杂性，不仅需要额外的分析，而且对冷冻干燥过程也是如此。

2.3.2.辅料特性与冷冻干燥工艺参数之间的联系

2.3.2.1.冷冻

配方的玻璃化转变温度（Tg’）显著影响冷冻干燥周期的冷冻步骤，主要影响初级干燥步骤。对于冷冻步骤，选择一个低于非晶态配方的Tg’和/或低于共晶配方的共晶温度（Teu）的最终冷冻温度至关重要，同时要保证足够的保持时间，以确保蛋白质在进入初级干燥步骤之前完全固化。因此，配方的Tg’越低，最终冷冻温度也应越低。

2.3.2.2.初级干燥前的退火处理

退火是一种引入冷冻协议中的热处理过程，样品在此过程中保持在Tg’以上和冰的熔点以下一定时间。当使用像甘露醇这样的结晶填充剂时，通常会应用此步骤，因为退火可以促进其结晶。当作为填充剂使用时，必须确保甘露醇完全结晶，以便在低于其共晶温度下进行干燥，并确保后续储存过程中蛋白质的稳定性不受影响。如果在冷冻干燥过程中甘露醇保持非晶态，它会与蛋白质相互作用并稳定蛋白质。在储存过程中结晶的甘露醇将不再与非晶态蛋白质相互作用，从而危及蛋白质的稳定性。

2.3.2.3.初级干燥

在初级干燥过程中观察到的塌陷（结构丧失）的温度称为塌陷温度（Tc）。在初级干燥过程中，通过升华去除水分，产品温度应保持在Tg’以下或至少低于Tc。如果初级干燥在Tg’和/或Tc以上进行，会诱导粘性流动，可能导致冷冻干燥产品的塌陷。塌陷是关于蛋糕外观的不良质量属性，因此应避免。塌陷可能会或可能不会影响蛋白质稳定性，这取决于塌陷的程度。因此，建议选择导致产品温度低于Tc的初级干燥条件。然而，对于常用的冷冻/干燥保护剂如蔗糖和海藻糖，这会导致冷冻干燥过程漫长且成本高昂，因为这些二糖的Tg’较低。对于高浓度抗体配方，糖的低Tg’被蛋白质本身的高Tg’所补偿。此外，由于随着抗体浓度的增加，粘度增加，Tg’和Tc之间的差值增大。Colandene等人发现，对于100 mg/mL的蛋白质配方，完全塌陷发生在Tg’以上约13°C。虽然对于高浓度蛋白质配方，可能可以在Tg’以上进行冷冻干燥，但对于低粘度配方，Tg’和Tc通常非常接近（Tc比Tg’高1-3°C）。为了使低浓度蛋白质配方能够快速冷冻干燥，通常会在配方中添加如甘露醇这样的填充剂来补偿非晶态配方的低Tg’。填充剂通常是像甘露醇这样的结晶化合物，它们不会对蛋白质稳定性做出贡献，但可以使冷冻干燥产品外观优雅。最近，Horn等人研究了作为甘露醇替代品的结晶氨基酸作为填充剂。这样的填充剂可能优于甘露醇，因为它们可以以比甘露醇低得多的浓度添加，同时交换更高的稳定剂含量，同时仍显示出完全结晶 。然而，这样的辅料通常需要退火以确保完全结晶，从而增加了冷冻干燥过程的复杂性。

2.3.2.4.次级干燥

次级干燥的目的是通过解吸去除未冻结的结合水，并实现低残留水分，通常小于1%。低残留水分对于确保在干燥状态下后续储存期间蛋白质的稳定性至关重要。较高的残留水分与冷冻干燥产品的Tg呈负相关，从而导致全球流动性增加，这对蛋白质稳定性不利。

2.4.冷冻干燥的一般配方“规则”

辅料的选择影响冷冻干燥工艺设计并影响工艺性能。此外，对于冷冻干燥配方，还应考虑以下方面：

• 蛋白质与糖的比例 • 总固体含量 • 填充高度 蛋白质与糖的比例对确保蛋白质稳定性的影响已经讨论过。此外，这个比例还影响配方的总固体含量，进而影响冷冻干燥工艺性能。较高的固体含量通常会促进更高的过冷度，从而产生许多通常尺寸较小的孔隙，因此显示出更高的干层阻力 。较高的干层阻力限制了质量传递，因此增加了初级干燥时间。从可制造性的角度来看，通常更倾向于较低的总固体含量。因此，对于较高的蛋白质浓度，应避免使用不贡献于蛋白质稳定性的填充剂，以及超出蛋白质稳定性所需的冷冻/干燥保护剂浓度。与较高的固体含量类似，较高的填充体积也会增加干层阻力。在升华过程中，随着瓶子中干燥部分的增加，获得的干层更厚，从而导致蛋糕阻力高。这通常需要更长的初级干燥时间，甚至可能导致熔化回流和/或显著的蛋糕收缩问题，除非对干燥条件进行优化。应选择与填充体积相适应的适当瓶子尺寸。作为一个经验法则，应避免填充体积超过瓶子尺寸的一半。

2.5.固体状态动力学

冷冻干燥的蛋白质配方可能是非晶态或结晶态，这取决于配方组成和/或冷冻干燥加工条件。非晶态配方缺乏长程有序，因此通常在固态中的反应性比结晶配方更高。一般来说，生物制剂（例如，单克隆抗体）的冷冻干燥配方本质上是非晶态的。除了配方组成外，玻璃动力学也影响冷冻干燥蛋白质配方的稳定性。动力学可能是全局的（⍺-松弛）或局部的（β-松弛）。玻璃化转变温度，Tg，是全局分子流动性的指标，传统上用于预测非晶态配方在固态中的稳定性。如前所述，Tg标志着粘性流动的开始。低于Tg时，非晶态配方表现为不可移动的玻璃态固体，而高于Tg时，非晶态配方转变为橡胶状或“流体状”状态。在许多情况下，观察到Tg与固态稳定性之间有很好的相关性。Duddu等人强调了Tg相对于储存温度的重要性。蔗糖配方（Tg≈59°C）在60°C时表现出不稳定性，与海藻糖配方（Tg≈80°C）不同。然而，在其他情况下，观察到的相关性较差。例如，像葡聚糖这样的高Tg辅料，并没有显示出比具有较低Tg的玻璃对于抗IL-1抗体配方更好的稳定性。同样，额外添加少量增塑剂（例如，山梨醇）降低了Tg，但改善了IgG1抗体蛋白配方的稳定性。全局流动性也可以通过结构松弛时间（τ）来评估，在某些研究中，与τ的观察到的相关性更好。τ是焓松弛中分子流动性的度量，代表非晶态固体的动力学。结构松弛代表从非晶态“玻璃态”到过冷态的玻璃松弛。Kohlrausch-William-Watts（KWW）方程表示结构松弛为：

其中τ代表结构松弛时间，β是伸展函数，表示松弛状态的分布。具有更高τ值的配方代表更好的稳定性。然而，在许多情况下，观察到与结构松弛参数的相关性较差，而局部（快速）运动与稳定性行为相关。局部（快速）运动可能在低于Tg的温度下主导分子流动性。快速动力学已通过多种技术进行了表征，包括中子散射，它测量氢在纳秒时间尺度上的运动的均方振幅，通过固体核磁共振（ssNMR）测量晶格自旋松弛时间，或者通过正电子湮灭寿命光谱学（PALS），它测量作为正电子寿命函数的自由体积。多项研究评估了快速局部运动（β松弛），与冷冻干燥蛋白质配方的储存稳定性相关。Wang等人评估了蔗糖水平对蛋白质储存稳定性的影响，以了解二糖对蛋白质稳定的贡献。蛋白质的物理稳定性随着蔗糖含量的增加而增加。通过中子背散射测量的快速局部流动性以及通过密度测量的自由体积随着配方中蔗糖水平的增加而减少，与稳定性趋势相匹配。Chang等人同样评估了含有蔗糖、海藻糖或与山梨醇与蔗糖或海藻糖混合的配方的影响。结构α-松弛时间τ，作为分子流动性的指标，也得到了表征。在基于蔗糖的配方中添加少量山梨醇导致保留更多天然结构，松弛时间更短，稳定性更高。对于基于海藻糖的配方，山梨醇对蛋白质结构没有影响，但显示出与基于蔗糖的配方相似的松弛时间减少和稳定性增加。

稳定性与基于蔗糖的配方的天然结构保留相关，但对于基于海藻糖的配方，结构松弛时间或天然结构无法预测稳定性。假设快速（β）松弛而不是慢速全局（⍺）松弛可能对稳定性更为关键。Chieng等人测试了人生长激素的冷冻干燥配方，作为非晶态羟乙基淀粉/二糖（蔗糖或海藻糖）配方，有和没有添加多元醇（山梨醇和甘油），并通过真实密度测量测量“自由体积”，通过中子背散射和PALS测量快速动力学（局部流动性）。自由体积变化、快速动力学局部运动和PALS孔径数据均与羟乙基淀粉/二糖系统的稳定性相关。ssNMR是另一种用于研究蛋白质在冷冻干燥状态下的动力学以及表征冷冻干燥蛋白质配方中快速运动的方法。自旋晶格松弛时间（T1，ns-s时间尺度）、旋转框架中的自旋晶格松弛时间（T1⍴，s-ms时间框架）和自旋-自旋松弛时间（T2，ms-s时间框架）都已用于确定快速运动，进而提供固体状态下分子流动性的信息。

Yoshioka等人评估了冷冻干燥的牛血清白蛋白（BSA）和γ-球蛋白（BGG）中质子的ssNMR自旋-自旋松弛时间（T2）作为水合水平的函数。当水分含量大于0.2 g/g蛋白质时，冷冻干燥的BSA和BGG容易聚集。冷冻干燥蛋糕中蛋白质的质子T2随着水分含量的降低而增加。随着水分含量的增加，聚集敏感性增加，这与蛋白质中质子的T2增加相对应。Mensink等人同样评估了IgG模型蛋白和糖（海藻糖、菊粉和葡聚糖）的ssNMR松弛时间（作为快速运动的度量），以与蛋白质储存稳定性相关。通过比较两个时间尺度上的ssNMR松弛时间来评估相容性，以提供2-5 nm和20-50 nm长度尺度上的相容性信息。相似的松弛时间表明相容性。较小的糖（例如，海藻糖）显示出与IgG蛋白更好的相容性，表明较小的糖与蛋白质之间有良好的相互作用。较大的糖（例如，菊粉和葡聚糖）表现最差，并在NMR长度尺度上发生相分离。固体状态氢-氘交换（ssHDX）也已用于与冷冻干燥状态下的稳定性相关。将冷冻干燥粉末中的蛋白质暴露于在特定湿度和温度下的重水。氘化水平反映了蛋白质-辅料相互作用以及构象稳定性。Moorthy等人评估了肌红蛋白配方的ssHDX-MS，并将ssHDX-MS趋势与固体状态下的储存稳定性相关。蔗糖配方显示出比含有甘露醇或氯化钠的配方更低的氘吸收和更好的稳定性。随着蔗糖含量的增加，ssHDX-MS交换减少，并与稳定性很好地相关。相比之下，稳定性趋势与傅立叶变换红外光谱（FTIR）的带强度不相关。在其他研究中，ssHDX-MS趋势与单克隆抗体的稳定性很好地相关。在一项关于牛血清白蛋白和重组人血清白蛋白的研究中，添加小电解质（LiCl、NaCl、KCl、RbCl和CsCl）改善了配方的稳定性。没有观察到与二级结构或全局流动性相关。然而，通过中子背散射或PALS观察到快速动力学与稳定性之间有很好的相关性。随着新技术的出现，对快速运动及其与蛋白质配方稳定性的相关性的理解引起了相当大的兴趣。对全局和局部运动的全面理解最终可能帮助配方师和工艺工程师开发出最佳的冷冻干燥配方。

3.产品质量属性

从监管角度来看，冷冻干燥产品必须符合注射剂产品的质量要求。冷冻干燥产品的质量要求可以进一步区分为重新配制后和在干燥固态中的要求。典型的药典重新配制后测试包括无菌性、内毒素和微生物限度、颗粒物质、颜色、浑浊度、pH值、纯度、效力和容器封闭完整性（CCI）。对于干燥的冷冻干燥产品，剂量单位的均匀性、外观（例如，颜色和质地）、重新配制时间和水分水平被列出。在产品和工艺开发研究中，识别影响期望产品质量的产品属性作为关键属性。关键质量属性（CQAs）需要根据预先定义的控制策略进行监测和/或控制。根据ICH Q8，关键质量属性是物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，应在适当的限制、范围或分布内，以确保期望的产品质量。反过来，期望的产品质量是由对安全和有效药物产品的需求驱动的。如上所述，进行典型的药典测试以测试冷冻干燥产品的潜在关键质量属性（pCQAs）。除了稳定性外，蛋糕外观和残留水分特别表明了工艺的稳健性。对于干燥的冷冻干燥产品的pCQAs，没有太多指导可用。根据21CFR610.13，每批干燥产品都应测试残留水分，并应符合并不得超过生物制品许可申请中备案的批准方法所规定的既定限度。在FDA关于注射剂冷冻干燥的检查指南的“冷冻干燥产品的成品测试”小节中，除了水分含量外，只提到了蛋糕外观，或者更准确地说是“熔化回流”，与产品稳定性有关。此外，由于水分较高和剂量挑战，熔化回流与稳定性问题相关，因为用户阶段的更高重新配制时间可能导致不完全溶解。以下部分关注重新配制前的冷冻干燥产品的属性；水分含量、比表面积（SSA）、蛋糕外观和重新配制时间被讨论，以考虑它们对产品稳定性和冷冻干燥工艺稳健性的影响。

3.1.残留水分

3.1.1.水对蛋白质稳定性的影响

水和蛋白质在分子水平上相互作用，涉及蛋白质的亲水性、疏水性和离子基团。在蛋白质的疏水区域附近，水分子形成排列良好的水簇。相比之下，与特定极性基团形成氢键。在水溶液中，与蛋白质没有直接接触的水分子（本体相）表现为自由水，对蛋白质分子没有影响。基于蛋白质与水的各种分子内相互作用机制，水分子与蛋白质分子的结合可以分为三个区域：

• 首先，水分子结合到高度活性位点，即带电和极性基团，并在蛋白质周围形成单层。

• 其次，当水分子与较弱吸附位点相互作用时，从单层到多层发生转变，例如肽链主干或由于膨胀效应而暴露的极性基团。

• 第三，多层区域，水分子在弱结合位点凝聚，松散结合的水层形成。不同层的出现取决于可用的水分，即水分含量。在冷冻干燥过程中，首先冷冻的本体水升华。接着，围绕蛋白质分子的水（作为多层）被去除，而蛋白质周围残留的单层依然存在。进一步干燥也将去除单层水。据推测，由于与蛋白质分子的强烈相互作用，单层水表现出较低的热力学活性。相应地，多层水被认为比单层水保持更高的自由水活性，这取决于其与蛋白质分子的距离。因此，决定蛋白质稳定性的不是绝对的残留水分含量，而是具有高水分活性的水量。将水分活性概念应用于冻干蛋白药物中残留水分的作用，低残留水分含量应是有益的，通过减少化学反应（如断裂、氧化、脱酰胺、变性或聚集）的可能性。相反，随着残留水分含量的增加，由于蛋白质分子的构象灵活性增加、水的流动性增加以及水作为反应伙伴的可用性增加，例如对于水解反应，化学反应的可能性增加。此外，水可能作为增塑剂降低玻璃化转变温度，导致流动性增加，如上文详细阐述。维持蛋白质稳定性的适当水分水平因产品而异，也取决于蛋白质及其降解途径。表3列出了并描述了调查水分含量对蛋白质稳定性影响的相关案例研究。从这些研究中可以得出结论，水分含量需要仔细平衡。一方面，过度干燥可能会导致结构水的去除，从而暴露蛋白质表面，可能导致聚集和活性丧失。另一方面，在超过单层的水分水平下，流动性和反应性增加，可能会损害构象和化学稳定性。流动性的增加可能导致构象变化，例如展开，这反过来又可能导致由疏水氨基酸残基暴露引起的不可逆物理聚集。由于水作为反应物导致化学不稳定的例子是脱酰胺反应和水解反应，高水平的水增加了反应速率。一个基于增加的构象灵活性和松散结合的水使反应物活化的化学降解例子是蔗糖制剂中的美拉德反应，更高的残留水分含量促进蔗糖水解，导致“褐变反应”。因此，将水分含量保持在略低于或等于单层水平似乎最为有益。

3.1.2.水分含量与工艺性能的关系

由于水分含量影响冻干产品的稳定性，因此为水分含量定义了规格限制。确保批次内和批次间的一致性也很重要。在一个批次内，冻干机内的热传递差异，例如边缘小瓶效应或搁板的温度不均匀性，应该被考虑，因为如果工艺不够稳健，它们可能会导致小瓶与小瓶之间的异质性。此外，优化次级干燥过程对于实现最终冻干药物产品的目标水分含量很重要。Vollrath等人比较了在1小时和6小时次级干燥后，受控成核（CN）蛋白制剂与随机成核（RN）处理的搁板的水分含量均匀性。他们使用频率调制光谱学来确定顶空水分压力，并计算相对标准偏差作为均匀性的替代指标。在1小时次级干燥后，他们发现CN样本（RSD为7.6%）和RN样本（RSD为13.1%）之间的均匀性存在显著差异。结果显示，对于稳健的工艺，允许完成次级干燥（在设定的次级干燥温度达到平衡）至关重要，这可以平衡冻干机依赖的干燥不均匀性。

3.2.比表面积

冻干产品的比表面积（SSA）受到制剂组成、冰成核温度（TN）以及在冷冻步骤和干燥过程中应用受控成核的影响。Konstantinidis等人报告说，较高的TN导致形成少量大冰晶，从而产生具有大孔和相应低SSA的冻干产品。相反，在较低的TN下，观察到大量小冰晶，导致SSA更高。在初级干燥过程中，大孔具有低产品阻力，导致初级干燥更快。相比之下，低SSA阻碍了次级干燥过程中的脱附，导致相对较高的残留水分水平。由于蛋白质通常对界面敏感，SSA成为一个重要的质量属性，特别是对于低蛋白质制剂。理论上，较低的SSA可能是有益的，因为产品暴露于降解反应的程度较低。然而，为了克服脱附受阻并实现低残留水分含量，次级干燥需要在更高的温度下进行。几项研究表明，较低的SSA改善了产品质量和/或稳定性：

• Hsu等人显示，随着蛋糕SSA的增加，乳光率增加。不同SSA的产品之间的残留水分和玻璃化转变温度被描述为相当。

• Schersch等人发现，由初级干燥期间的塌陷产生的低SSA对药学相关蛋白质（例如，单克隆抗体型IgG1、LDH）的稳定性有益。

• Awotwe-Otoo等人观察到，通过CN与较低SSA相比，随机成核（RN）产生的较高SSA的冻干物中IgG1-糖基化程度较低。此外，SSA可以用于研究工艺性能。如上所述，显著低于Tg’的干燥可能导致漫长且昂贵的冻干过程。因此，尽可能接近Tg’或Tc进行干燥是理想的。然而，需要确保工艺的稳健性。通过确定产品的SSA，可以检测到微观塌陷。由于微观塌陷不一定导致不优雅的蛋糕，因此不会通过视觉检测到，但它可能会影响质量属性，如残留水分含量和蛋白质稳定性。因此，确定产品的SSA有助于开发稳健的冻干工艺。

3.3.蛋糕外观

蛋糕外观是冻干产品中最不具体且最具争议的属性。通常通过肉眼检查冻干产品的外观，这本质上会导致由于主观评估而产生的变化。通常，从一个标准到下一个标准也没有明确的界限。在一篇评论中，Patel等人提供了一份详细的列表和描述，列出了各种蛋糕变形或缺陷，如塌陷、回流、气泡、雾化、冻干环、裂纹蛋糕、火山口、膨胀或产品位于小瓶和塞子之间。需要分析方法来定性和定量地表征冻干蛋糕。Haeuser等人评估了三种不同的成像技术：三维激光扫描、聚二甲基硅氧烷嵌入和微型计算机断层扫描（μ-CT），以评估蛋糕外观。结果与视觉检查或扫描电子显微镜进行了比较。根据他们的评估，μ-CT是一种工具，它不仅能够定性和定量地评估蛋糕的外部，还能够评估蛋糕的内部结构。使用改进的μ-CT方法，Haeuser等人表明，通过玻璃小瓶非侵入性地对蛋糕和内部蛋糕结构进行表征是可行的，因此提供了一种有前景的技术，以支持冻干工艺开发、放大和工艺转移。一般来说，优雅且均匀的蛋糕是首选。然而，不均匀或不优雅的蛋糕并不一定意味着稳定性问题。Schersch等人已经表明，在相似的残留水分水平下，塌陷的蛋糕可能比其优雅的对应物更稳定。除了变形蛋糕可能对稳定性产生的影响外，从批次到批次具有可重复的蛋糕外观至关重要。对于最终用户来说，均匀的蛋糕外观也是可取的，以避免不确定性和投诉。

3.4.重构时间

根据美国药典（USP），重构的终点是在固体完全溶解且无法检测到可见残留物时达到的。因此，重构时间的确定通常基于视觉检查。正确确定重构的结束是一个关键的安全方面，因为不完全溶解可能导致剂量不准确，特别是对于通过在线过滤器给药的注射产品；此外，还存在注射固体的风险。冻干产品的重构时间取决于多种因素，如总固体含量、初级包装配置、制剂、SSA和水分含量。较高的固体含量会导致蛋糕密度增加，因此重构时间更长。对于较高的固体含量，使用更大的小瓶尺寸以减少蛋糕高度可能是有益的。SSA对重构时间的影响之前已经讨论过。理论上，较高的SSA应该有助于蛋糕润湿，因此改善重构。然而，SSA并非影响重构时间的唯一决定因素。

• Cao等人研究了减少Fc融合蛋白重构时间的方法。他们研究了润湿剂，如聚山梨酯和酒精，并将其添加到稀释剂中。此外，还涉及了诸如退火等工艺参数。这些策略被发现对重构时间的减少影响较小。然而，使用减少的稀释剂体积进行重构显示出显著的四到七倍的重构时间减少。在这种策略中，通过冷冻干燥较低浓度的溶液，然后用较小体积重构以达到所需的蛋白质浓度，从而降低了蛋糕密度。

• Schersch等人没有观察到由于塌陷导致重构时间增加，尽管产品的SSA显著降低。

• Geidobler等人发现较低的SSA对高浓度蛋白质溶液的重构有益。他们推测较大的孔径有助于在粘性溶液中润湿蛋糕。

• Beech等人将重构行为与蛋糕曲折度相关联，以便于液体流动。他们还提出了基于达西定律和哈根-泊肃叶方程的孔径与重构时间之间的幂律关系，以及可能存在的孔径“截止值”，低于此值时，冻干制剂的重构时间变得不切实际地长。冻干产品的重构时间是一个尚未完全理解的产品属性。此外，其确定的主观性构成了一个主要挑战。Cao等人表明重构协议可以对重构时间产生影响。由于终点是通过视觉确定的，操作者方法的变异性增加了挑战。因此，定义一个清晰的重构协议和时间在包装插页中至关重要，以确保患者安全。

4.结论

由于其对冻干工艺性能以及药物产品质量的影响，设计最佳的蛋白质制剂需要谨慎选择辅料。本章介绍了冻干蛋白质制剂设计的一般概念，包括典型的辅料、蛋白质辅料稳定机制，包括对固态动力学的影响，以及冻干药物产品的质量属性。

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