我们根据分子量、单糖组成、甲基化、傅里叶变换红外光谱和核磁共振对绵萆薢多糖的结构进行了表征（图1）。

BXP的化学均匀性较好，我们通过HPLC-GPC方法检测到单峰形状（图S1B）。同时，我们使用SEC-MALLS-RI法测定BXP的重均分子量为10.432 kDa；通过单糖组成分析，BXP被确认为异质多糖，由Glc（96.98）和Gal（3.02%）组成，表明BXP主要由葡萄糖组成（图S2）。

BXP的红外分析结果（图1F）特征性地识别了糖的特征组。3246 cm ^{− 1} 处的宽峰是由于O-H的伸缩振动，以及C-H在2928 cm ^{− l} 处的伸缩振动。1609和1407 cm ^-1 处的吸收峰是由于O-H和C-H的角振动引起的。1015 cm ^-1 处的峰值为C-O的弯曲振动。915 cm ^-1 的峰被确定为特征β型吡喃糖苷，而915 cm ^-1 处的峰被识别为特征α型吡喃苷。

对BXP进行甲基化分析以鉴定单糖连接，如表1所示。BXP被证实有五种不同的单糖键，包括t-Glcp-（1→，t-Galp-（1→，→4）-Glcp-（2→，→3,4）-Glcp-（1→，→4,6）-Glcp-（1→，摩尔比为32.1:0.98:59.03:398:3.92。最后，BXP被认为主要由→4）-Glcp-（1→和t-Glcp-（1→组成。

结合上述单糖组成分析和甲基化分析，我们将BXP进一步通过1D和2D NMR谱进行分析（图1A~E），以鉴定单糖单元及其连接位点和序列。BXP的NMR数据如表2所示。

¹³ C NMR谱显示，δC 101.43、99.33-99.68、91.83、98.02、95.70和95.83处的异头碳有六个主要特征信号，我们推断存在六种不同的糖模式，分别命名为A、B、C、D、E和F。我们通过1D和2D NMR数据分析发现，BXP中的六个残基最终被指定为→4,6）-α-D-Glcp-（1→，→4）-α-D-Glcp-（1→，t-α-D-Glcp-（1→，t-β-D-Glcp-（1→，→3,4）-β-D-Glcp-（1→，t-β-D-Galp-（1→。

对于残基A，由于 ¹ H、 ¹³ C NMR和HSQC分析，异头信号为δ _H/C 5.29/101.43，我们推测其为α-构型。根据HSQC和 ¹ H- ¹ H COSY谱中的相应相关性，从H-2到H-6的残基化学位移分别为δ _C/H 71.67（3.50）、73.14（3.82）、75.87（3.60）、72.28（3.66）和68.85（3.31）。这些数据与甲基化和文献参考吻合，我们将残基A鉴定为→4,6）-α-D-Glcp-（1→。

对于残基B，根据HSQC分析，我们发现了六个碳信号和一个氢信号之间有一个主交叉峰，这解释了与甲基化数据一致的主要糖单元，因此异头信号为δ _H/C 5.29/99.33-99.68。异头信号表明B具有α构型。根据HSQC和 ¹ H- ¹ H COSY谱中的相应相关性，从H-2到H-6的残基化学位移分别为δ _C/H 71.79（3.50）、72.80（3.86）、76.60（3.55）、67.42（3.73）和60.42（3.8 6）。这些数据与甲基化和文献参考相吻合，我们将残基B鉴定为→4）-α-D-Glcp-（1→。

对于C、D、E和F的其他残基，由于 ¹ H、 ¹³ C NMR和HSQC分析，异头信号为δ _H/C 5.12/91.83，我们推测C为α构型，D、E、F为三个β构型。C、D、E和F从H-2到H-6的化学位移也由HSQC和1H-1H COSY谱中的交叉峰确定，如表1所示。这些数据与甲基化和文献参考吻合，我们将C、D、E和F鉴定为t-α-D-Glcp-（1→，t-β-D-Glcp-（1→，→3,4）-β-D-Glcp-（1→，t-β-D-Galp-（1→。

根据HMBC分析，相关信号提供了主要残基之间的连接位点和序列。H-1（B）/C-4（B）的HMBC相关性确定了→4）-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glc p -(1→结构片段；H-1（B）/C-4（E）的HMBC相关性揭示了存在→4）-α-D-Glcp-（1→4,3）-β-D-Glcp-（1→；H-1（D）/C-4（A）的HMBC相关性确定了t-β-D-Glcp-（1→4,6）-α-D-Glcp-（1→4）相连接；H-4（B）/C-1（D）的HMBC相关性确定了存在t-β-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-（1→片段；H-4（A）/C-3（E）之间的HMBC相关性揭示存在→1）-α-D-Glcp-（6,4→3,4）-β-D-Glcp-（1→结构片段。未发现其他残基的HMBC交叉峰，这可能是由于其他残基含量较低以及重叠的HMBC相关信号。综上所述，BXP的可能结构如图1G所示，其主要由t-β-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-，以及→1）-α-D-Glcp-（6,4→3,4）-β-D-Glcp-（1→的侧链组成。

图2 BXP对HUA小鼠体重和生化指标的影响。 （A）本研究的实验设计。（B）15天内小鼠的体重。（C）血清尿酸水平（SUA）。（D）血尿素氮（BUN）。（E）肌酐（CR）。（F）甘油三酯（TG）。（G）总胆固醇（TCHO）。（H）低密度脂蛋白（LDL-C）。（I）高密度脂蛋白（HDL-C）。结果显示为平均值±标准差（n=6）。与对照组相比，#P<0.05；与MOD组相比，*P<0.05。

图2B显示了BXP对CON组和HUA组（MOD、PC、BXP-L、BXP-M、BXP-H）小鼠体重的影响，表明BXP对小鼠没有不良影响，而PC组体重下降与别嘌呤醇的副作用有关。MOD组的血清尿酸（SUA）水平高于CON组，并且通过补充BXP或别嘌呤醇使其正常化（图2C，P<0.05）。此外，MOD组血清BUN和CRE水平显著升高，表明HUA引起肾功能衰竭（图2D，E，P<0.01）。为了研究BXP多糖对HUA小鼠其他生化指标的影响，我们还检测了HUA小鼠的脂质水平。MOD组LDL-C、TG和TCHO水平高于CON组（图2F-H，P<0.05），而MOD组HDL-C水平低于CON组（见图2I，P<0.05）。此外，不同剂量的BXP处理组显示血清BUN水平显著降低（P<0.01），表明BXP缓解了HUA小鼠的异常BUN积累。我们发现BXP降低了HUA小鼠的血清UA和BUN水平，这表明其对HUA有潜在的治疗作用。BXP还可以剂量依赖性地改善HUA小鼠的LDL-C、HDL-C、甘油三酯和总胆固醇水平，表明它可以改善血脂异常。这些结果表明，BXP能有效改善HUA小鼠的血清生化指标。

我们在MOD组观察到血清XOD活性增加，BXP预处理剂量依赖性地降低了XOD活性（图3A）。此外，MOD组肝脏中XOD蛋白表达增加，而PC和BXP组的XOD蛋白水平降低，特别是BXP-H处理后显著降低了XOD活性（图3B，P<0.05）。所有这些都表明，BXP可以通过抑制XOD的表达来降低尿酸含量。鉴于XOD对BXP的抑制活性不如PC，进一步研究BXP降低尿酸的机制至关重要。

图3 BXP对HUA小鼠UA生成和代谢的影响。 （A）肝脏XOD活性。（B）肝组织中XOD蛋白表达水平的蛋白质印迹分析。GAPDH用作参考。（C）小鼠肾脏ABCG2、OAT3、OAT1、URAT1和GLUT9表达水平的蛋白质印迹分析。GAPDH用作参考。结果显示为平均值±标准差（n=6）。与对照组相比，#P<0.05；与MOD组相比，*P<0.05。

因此，我们研究了尿酸代谢的几个关键转运蛋白，包括ABCG2、OAT3、OAT1、URAT1和GLUT9。与CON和PC组相比，MOD组肾组织中ABCG2、OAT3和OAT1的表达大大降低，而GLUT9和URAT1的表达相反，表明肾功能受损。至于对照组，别嘌呤醇将PC组的上述蛋白质恢复到正常水平（P<0.05）。高剂量BXP对GLUT9、OAT1、OAT3、URAT1和ABCG2的表达具有相似的作用（图3C，P<0.05）。这些结果表明，BXP通过调节肾尿酸转运蛋白的表达来降低UA。

与CON小鼠相比，MOD小鼠的体重下降，而肝脏（图4A）和肾脏（图4B）系数大大增加（P<0.05），进一步证实了HUA小鼠的肾脏和肝脏损伤。此外，PC组的体重减轻更为明显，肝肾系数也上调，表明别嘌呤醇对肾脏造成了严重损害。BXP干预后，肝脏和肾脏系数大大降低（P<0.05），表明高剂量BXP对HUA小鼠的身体状况具有保护作用。肾脏组织病理学分析显示，MOD组存在大量增殖的纤维组织和浸润的炎性细胞（图4C），许多集合管和肾小管不规则且略有扩张。此外，我们还观察到肾小管上皮细胞坏死、管腔内细胞碎片和细胞质疏松。BXP可以缓解上述病理损伤，特别是在中高剂量下。

在此，我们通过免疫荧光分析了α-SMA和E-cad的表达（图4D）。与CON相比，MOD和PC组的α-SMA表达上调，E-cad表达下调，表明肾纤维化进展（图4E，P<0.05）。对于E-cad的表达，PC组低于MOD组，表明别嘌呤醇可能会加剧肾纤维化。与对照组相比，不同剂量的BXP有助于将纤维化相关蛋白恢复到正常表达水平（P<0.05），表明BXP减少了HUA对肾脏的损伤。BXP对HUA小鼠的肝肾有很好的保护作用。

H&E染色显示，HUA小鼠存在炎症细胞的黏膜下浸润、上皮损伤和隐窝变形的情况，而这些已被BXP修复（图5A）。在HUA小鼠中，与CON组相比，绒毛高度大大降低（P<0.05），高剂量BXP改善了绒毛高度，反映了其有益的肠道作用。肠通透性的增加可以反映肠黏膜的损伤，是评估肠屏障功能的重要指标。肠黏膜的机械屏障主要由紧密连接蛋白组成，包括ZO-1、occludin和claudin。MOD组显示ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表达明显低于CON组，而BXP则剂量依赖性地增加其表达，表明肠黏膜屏障增强（图5B）。因此，BXP可以改善HUA小鼠的肠道屏障功能，这可能与肠道通透性的恢复有关。

在高尿酸血症小鼠中，肠道通透性和屏障功能受损可导致肠瘘，使LPS进入血液，引起炎症和健康问题。本文进一步研究了HUA小鼠肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。如图6A-C所示，与CON小鼠相比，MOD组的TNF-α、IL-1β和IL-6显著增加（P<0.05）。别嘌呤醇和BXP显著逆转了HUA小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的升高（P<0.05）。血液中LPS的上调与肠道通透性受损有关，这增加了全身炎症和对其他器官的损伤。因此，我们通过ELISA和免疫印迹检测了LPS-TLR4-MYD88-NF-κB的炎症途径。正如预期的那样，与对照组相比，MOD肾脏中的LPS含量明显增加，不同剂量的BXP有助于降低LPS水平（P<0.05）（图6D）。在蛋白质印迹实验中，与CON组相比，MOD组的所有三种蛋白质（TLR4/MYD88/NF-κB）表达均上调，而不同剂量BXP处理组表达均降低（图6E，P<0.01）。上述结果清楚地表明，BXP缓解了LPS在肾脏中引发的炎症反应，减少了肾脏损伤，使肾脏代谢功能正常化。

图6 BXP对HUA小鼠肾脏和肠道炎症的影响 。 （A−C）肠组织中炎性细胞因子TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）的水平。（D）肾脏LPS水平。（E）肠组织TLR4、P-NFκB p65和MYD88蛋白表达水平的蛋白质印迹分析。GAPDH/NFκB p65用作参考（n=6）。与对照组相比，#P<0.05；与MOD组相比，*P<0.05。

与CON组相比，MOD组的α多样性指数（Ace、chao、Shannon和Sobs指数）降低，表明HUA小鼠的肠道环境组成更为相似。BXP处理显著增加了α多样性，表明物种丰富度成功恢复（图7A-D，P<0.05）。主坐标分析（PCoA）显示，基于Bray-Curtis距离，不同组的群落组成存在明显的聚类（图7E）。通过门和属水平的分类组成探索了微生物群落的变化。在门水平上，BXP组的微生物群落更接近CON组，厚壁菌门和拟杆菌门是主要的细菌群落。与CON组相比，MOD组中拟杆菌减少和厚壁菌相对丰度增加，但BXP干预后相对丰度逆转（图7F，H，I）。图7G显示了丰度最高的前10个属。与MOD组相比，BXP增加了乳杆菌、阿克曼菌的丰度，降低了 norank-f-norank-o-Clostridia-UCG-014 、 norank-f-Muribaculaceae 、拟杆菌的丰度。为了深入研究差异生物标志物，我们通过线性判别分析（LDA）-结合效应大小测量（LEfSe）进行了高维分类比较。图7J、K显示，25个OTU（LDA>4）在门、纲、目、科和属水平上存在显著差异，表明各组之间存在独特的微生物群落结构。图7L中的热图描绘了BXP和MOD组之间不同的肠道微生物群结构和组成，表明BXP调节了HUA小鼠的肠道微生物群落。

图7 BXP对HUA小鼠肠道菌群的影响 。 （A-D）α多样性分析。（E）加权UniFrac PCoA。（F）门水平细菌分类分析。（G）属水平的细菌分类分析。（H，I）属水平上肠道微生物群的相对丰度。（J，K）物种差异分析，Cladogram图，Lefse分析LDA值>4。（L）属水平的相对丰度如热图所示。（M）高尿酸血症相关指标与属水平肠道微生物群分布变化的Spearman秩相关热图。红色表示正相关，蓝色表示负相关。数据表示为平均值±SD，n=6。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

我们使用Spearman秩相关系数进一步评估了高尿酸血症主要指标与肠道微生物群之间的关联（图7M）。结果表明，乳杆菌与UA和TNF-α水平、GLUT9和OAT3表达呈负相关，与OAT1、occludin表达呈正相关。 Alistipes 与UA水平、GLUT9、OAT3表达和IL-6水平呈正相关。ABCG2的表达与 Blautia 和 norank_f_Lachnospiracae 呈负相关。与MOD组相比，BXP降低了UA、TNF-α水平、GLUT9表达，增加了occludin、ZO-1、claudin-1表达，这与乳杆菌丰度的增加是一致的，表明高尿酸血症缓解的机制是通过抑制GLUT9表达和增加乳杆菌的丰度来实现的。

我们根据PICRUSt2对脂质代谢中潜在改变细菌的分析（图S4），我们进一步对小鼠血清样本进行了代谢组学分析，以筛选参与代谢的脂质代谢物。主成分分析结果显示，质量控制样品紧密聚类，表明该分析系统具有良好的稳定性和可重复性（图S5）。而且，在PCA分析的评分图中，CON、MOD和BXP-H组之间存在明显的差异，表明代谢物存在显著差异。我们通过建立正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型进一步探索了差异代谢物（图8A，B）。OPLS-DA显示，CON和MOD小鼠的代谢特征存在显著差异（图S6），反映了HUA小鼠血清代谢的紊乱。MOD和BXP-H小鼠也有不同的代谢特征（图8C）。OPLS-DA模型的VIP值（VIP＞1）和t检验的p值（p＜0.05）确定了191种差异脂质代谢物，包括100种上调和91种下调（图8D）。BXP组和MOD组共检测到129种显著不同的代谢物，其中29种上调，100种下调。代谢产物聚类热图分析显示，在前30种脂质代谢产物中，BXP处理逆转了10种代谢产物，包括PC（16:0/20:4（8Z、11Z、14Z、17Z）），PE-NMe（20:3（5Z，8Z，11Z）/18:1（11Z）），PC（16:0/18:2（9Z，12Z）），1-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine，PC（20:3（5Z，8Z，11Z）/18:0），PC（18:2（9Z，12Z）/18:00），PC（18:1（11Z）/16:1（9Z））、PC（20:2（11Z，14Z）/20:4（8Z，11Z，14 z，17Z）），PC（22:6（4Z、7Z、10Z、13Z、16Z、19Z）/16:0），PE（15:0/22:2（13Z，16Z））和缓解HUA小鼠的代谢紊乱（图8E）。

随后，我们分析了代谢途径，其中大部分与氨基酸和脂质代谢有关（图S7A）。在MOD组中，与CON组相比，NF-κB通路表现出显著的激活，而在BXP组中则受到显著抑制。这与上述LPS-TLR4-MYD88-NF-κB炎症途径的实验结果一致，进一步证实了BXP可以通过该途径治疗高尿酸血症（图S7B，C）。-log（p）和影响值表明，甘油磷脂、α-亚麻酸、亚油酸代谢、花生四烯酸和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是与高尿酸血症相关的前五大途径（图8F），我们进一步研究了它们与肠道微生物群的相关性。

肠道菌群的生态失衡通常会导致SCFA的变化，SCFA可以为肠道上皮细胞提供能量，促进尿酸排泄，并对缓解高尿酸血症产生重大影响。为了研究BXP对SCFA生产的影响，我们测试了各种酸的含量，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、己酸（图9A）。MOD组SCFA总含量降低，但高剂量BXP恢复了这一变化（图9B，P<0.05）。与CON组相比，MOD组的乙酸和丁酸显著降低（P<0.05），丙酸含量没有显著差异（图9C）。高剂量BXP对乙酸含量的恢复尤其有贡献，表明BXP可能通过调节SCFA含量来缓解HUA。

HUA和痛风经常伴随脂质代谢紊乱。然而，很少有报道表明，由肠道微生物调控的脂质代谢紊乱与高尿酸血症（HUA）有关。Pearson的相关性分析是为了检验参与脂质代谢的几种代谢物、细菌分类群和生化标志物之间的相关性。研究结果表明，几种代谢物与微生物群和生化物质的变化之间存在很强的相关性。具体而言，我们发现参与甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢和亚油酸代谢的PC（16:0/20:4（8Z，11Z，14Z，17Z））与肠道微生物的关联最强（图9D）。PC（16:0/20:4（8Z，11Z，14Z，17Z））与 Odoribacter 、 Blautia 、 Alistipes 、 Lachnospiraceae_NK4A136_group 呈负相关，与阿克曼菌、 Dubosiella 和 Coriobacteriaceae_UCG-002 呈正相关。对于脂质代谢中不同代谢物与生化参数之间的相关性，PC（16:0/20:4（8Z、11Z、14Z、17Z））与TG、UA、LPS、BUN、OAT3、XO和URAT1蛋白表达水平、IL-1β、TNF-α和IL-6炎症因子水平呈正相关，而与OAT1和ABCG2蛋白表达呈负相关（图9E）。肠道微生物组-代谢组-高尿酸血症轴的相关网络表明了BXP处理期间的一般关系。BXP通过促进肠道微生物群和脂质代谢组之间的交流来减少高尿酸血症。这支持了用BXP治疗的HUA小鼠脂质代谢变化是由于微生物群变化的观点。BXP对肠道微生态系统和脂质代谢的影响表明，BXP可以通过稳定肠肾轴来改善高尿酸血症的状况。

总之，高尿酸血症通常发生在肾病中，并可导致患者肾功能损害。本研究首次从抗HUA中药绵萆薢中分离纯化BXP，并探讨其缓解高尿酸血症的作用。代谢组学和16S rRNA基因测序用于从肠肾轴的角度揭示BXP的抗高尿酸血症机制。通过FTIR、GPC、HPLC和NMR分析，我们首次报道了BXP的结构，其结构被确定为t-β-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-，以及侧链为→1)-α-D-Glcp-(6, 4 → 3, 4)-β-D-Glcp-(1→。在HUA小鼠模型中，BXP降低了体内的尿酸水平，预防了HUA诱导的肝肾损伤，并减轻了肾纤维化。然后，微生物组和代谢组学的结果表明，BXP上调了肠道中细菌的丰度，逆转了HUA引起的脂质相关代谢紊乱。这些表明，BXP有可能通过小鼠的肠肾轴缓解HUA和肾脏疾病（图10）。