亲们，小七课堂本周环保课堂第二季终于来啦，本季小七有幸为大家请来浙大的张文武博士，为大家带来废水处理的知识，赶紧来=先睹为快。
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小七环保线上课堂第二季
1.主讲嘉宾介绍
张文武博士，毕业于浙江大学生命科学学院微生物所，获微生物遗传学博士学位。
张博士本硕博期间均在浙江大学嗜极微生物实验室从事工业污水处理中耐盐微生物应用有关研究，并作为生物技术骨干参与了多项医化水处理项目的建设和运营。
从业期间，张博士申请专利20余项，发表SCI论文、核心期刊论文十余篇，为多家设计院、企业项目提供了技术支持。
2.主讲主题
废水微生物毒性的半定量测定方法。
原理与意义
1.为什么要半定量测废水的毒性？
在工业生产中，有许多特殊污染物在浓度达到一定要阈值后会对污水的生物处理造成抑制作用甚至毁灭性破坏，例如重金属、抗生素、氰化物、硝基苯等等。在污水站日常管理中，运营人员需要对各股进水的生物毒性有一定了解，在有机负荷管理的基础上加强毒性废水的定量管理，对于有毒废水进行节制，避免系统出现意外效率降低、解絮、死泥的情况。
但是，实际情况下，我们很难全面、定量地去推测污水中的各种污染物组成，其微生物毒性往往是不明确的。因此，我们需要有一套直观、简易、普适性强的检测方法来告诉我们水样的毒性如何。
2.如何测定？MIC—最小抑菌浓度测试
对样品进行一系列浓度梯度的稀释后，我们把各浓度样品添加到细菌培养物中，通过观察细菌生长状况，从而判断各浓度样品对细菌生长的抑制作用大小，即微生物毒性大小。
其中，能够有效抑制细菌生长的最低浓度称为最小抑菌浓度。MIC测试是衡量抗生素药物对各类致病菌药效的的传统手段，同时也可以拓展外延到水处理领域，衡量水样对各类微生物的抑制作用。
（3）如何测定？发光细菌抑制测试《GB/T15441-1995》
把样品添加到发光细菌培养物中，通过观察发光的变弱程度，从而判断各浓度样品对各种细菌代谢的抑制作用，即微生物毒性大小。这种方法基本原理与MIC法类似，但是因其直接观察与代谢相关联的光强，检测起来可以非常快速，通常5-30分钟即可表征废水的急性毒性。
介形虫、鱼类、藻类等水生生物均可作为检测媒介。
实验材料
1.菌株：
以金黄葡萄球菌 ATCC 25923 作为革兰氏阳性菌代表菌株，以大肠埃希菌 ATCC 25922 作为革兰氏阴性菌代表菌株。
如遇特殊活性污泥系统，可以先采用高通量测序调查现场实际活性污泥中的代表微生物种类，再以实际代表种类作为试验考察的媒介菌种。
2.试剂材料：
（1）液体LB培养基，无菌水、0.22μm滤器、巴氏吸管、镊子、待测水样、纱布、棉绳。
（2）容器：锥形瓶，试管（带透气试管塞）
（3）设备：恒温振荡培养箱、100μL移液器、5ml移液器、插管式分光光度计、蒸汽灭菌锅、无菌室。
测试步骤
1.菌种的活化（无菌操作）
将冻干管远离菌种的一端在酒精灯烧热，滴一滴无菌水在上面，使冻干管一头因骤冷而碎裂，完成开管。
用巴氏吸管吸取约0.5ml无菌水加入冻干管反复吹吸溶解菌种粉末。
吸取菌粉溶液，滴一滴（约30μL）到预先装有3ml LB培养基的试管中，即完成接种。每个菌种每次活化至少接种三管，以免因偶然因素导致活化失败。
接种好的试管塞好试管塞，放入35℃培养箱120rpm振荡培养6-18小时活化，可见培养基明显变浑浊。
用插管式风光光度计读取菌液浓度（λ=600 nm），当试管菌液OD=0.5左右时，即到菌种生长对数期，将其转接到装有稀释三倍的LB培养基的锥形瓶中扩大培养（接种量1%）。在相同条件下培养到OD=0.5左右时，活化完成。
2.水样处理（无菌操作）
取待测水样调节到中性，在无菌室用0.22μm滤器过滤除菌（如有悬浮物，先混凝沉淀再除菌），并用无菌水稀释到1×，10×，20×，30×…100×等梯度（可根据自身需要适当调整试验梯度）。
将各稀释梯度的水样2ml与1ml LB培养基混合到试管中，每个梯度做四个平行管，另设六个2 ml无菌水+1ml LB培养基的试管平分为两组作为空白阳性对照和空白阴性对照组。
用移液器将活化好的菌液30μL接种到各梯度试验组中的三个试管以及空白阳性对照组中；空白阴性对照组以及各梯度试验组中留有一个试管不接种菌液作为控制阴性对照，而接入30μL的无菌水替代。
3.培养与结果读取
取将各组试管置于35℃培养箱120rpm振荡培养，每隔6h在风光光度计上读取一次OD值并记录。
未接种的实验组OD不应增长，即不应有微生物生长，否则表明有污染，结果假阳性增多。
空白阳性组OD应全部明显增长，否则，说明活化菌液有问题或接种操作不当，结果假阴性增多。
以50个待测水样，11个稀释梯度的MIC测试为例。总计（11个梯度×4个平行管×50个水样+6个阴阳对照）×葡萄球菌和大肠杆菌共计2套=4412次试验，一般在24小时内读取完数据，总计五个读数点，即22060个数据。
总计理论需要准备4412次×0.03ml=133ml活化菌液，实际要准备200ml；理论需要LB培养基4412次×1ml=4.5升，实际准备5L。实验室条件有限的情况下，建议分批试验。
4.结果分析
（1）无毒水样：各个稀释梯度下菌种都能正常生长。
（2）低毒性水样：各个稀释梯度下菌种都能生长，但是稀释倍数低时，菌种生长受抑制。
（3）中等毒性水样：稀释倍数低时，菌种无法生长，但是稀释十倍以上，菌种可以生长。
（4）高毒性水样：稀释十倍以上仍然会抑制菌种生长，需要稀释很高倍数才能解除抑制。
（5）有益水样：适当梯度下可以促进菌种生长，导致OD值高于阳性对照。
（6）不可靠结果：无论接种与否或者有无废水，菌种都不生长或者阴性有菌种生长。
（7）偏向结果：大肠杆菌和金葡球菌结果不一致，说明废水对革兰氏阴性阳性菌的毒性不同，多见于抗生素废水或者重金属废水等，通常只要有一类微生物生长受影响，都认为该废水对活性污泥有毒。
（8）最小抑菌稀释倍数：例如试验中发现某水样稀释10倍后菌种生长不受抑制，则实际工程控制时应乘以2即20倍作为该废水进入生化系统的最小抑菌稀释倍数，即进水比例不应大于5%（仅考虑毒性管控，同时负荷管理应符合综合进水负荷的要求）。
（9）同水不同结果：指的是不同时间段取得的同一工段水样毒性大小不同。有可能是倒罐、改原料等生产不稳定因素造成的，通常伴随COD或氨氮波动，应当作为新水样来看待，并在实际管理中考虑波动因素。
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