撰文 | 觉主在路上
近年来，3D培养的肠道类器官模型（organoids）因其能够很好的模拟肠道稳态和疾病进展而被广泛使用。然而，这种培养模型仍然存在一些缺点，比如封闭的结构（closed cystic structure）、有限的寿命和高度的异质性等等【1】。基于此，研究人员也在不断的开发器官芯片（gut-on-a-chip），器官芯片为肠道类器官提供了生长支撑，使得细胞极性得以展现，同时包含了流动相通道，更好的模拟肠道内环境。但是目前主流的器官芯片仍是平面培养（planar culture），不能很好的重现肠道隐窝解剖结构，且通道相对单一，限制了多种细胞如免疫细胞、内皮细胞等共培养的可能【2,3】。
为了更好的模拟体内肠道的空间结构和复杂功能，进一步提升类器官技术的转化能力，近日，来自洛桑联邦理工学院和罗氏人类生物学研究所的Matthias Lutolf团队在Cell Stem Cell上发表了文章Bioengineered human colon organoids with in vivo-like cellular complexity and function。研究人员开发出新型的类器官模型“迷你结肠（mini-colon）”，这种模型具有和人类肠道高度相似的细胞更新能力、多种细胞类型和分化程度，并且能够不用传代而进行相对长期培养。
迷你结肠模型的基本结构
该“迷你结肠”结合了类器官和器官芯片技术，在芯片二甲基硅氧烷（PDMS）装置中部注入水凝胶支架，支架使用激光烧蚀技术进行修饰，以形成和结肠隐窝三维结构相似的管状微通道（图 1A）。将肠类器官消化成为单细胞，接种在微通道中，加入所需培养基后开始震荡培养，在接下来的几天内发现，这些细胞迅速附着在通道表面，逐渐形成连贯、紧密并不断增厚的上皮层。经组织形态学验证，模型内上皮层内柱状上皮细胞沿微通道自下而上形成中空管腔，细胞核位于基底面，细胞连接处高表达蛋白E-cadherin，形成紧密连接的功能屏障。这些特征和人类结肠形态和基本功能保持一致。
图 1. 迷你结肠的基本结构
迷你结肠的组织结构和功能鉴定
以往的类器官培养过程中通常使用一种培养基，这种方法会导致类器官过度增值（增殖培养基中）或降低增殖（分化培养基中）的能力。肠隐窝的底端和顶端细胞类型和功能是不相同的，所需要的营养成分也就不同。该系统从第七天起更换培养基，在隐窝基底面提供含有NRG1的培养基，从而更好的保持底部干细胞区域的增值能力，同时在顶端提供去除EGF的培养基，以利于顶端细胞更好的成熟和分化（图 2A）。该系统具有震荡功能，可以使得培养基保持流动状态，更好的模拟肠道环境，清除从隐窝脱落的细胞，始终保持隐窝的良好环境 (图 2B)。从MKi67和EdU染色实验可以看出，增值细胞集中在隐窝底部，3-4天后，Edu+细胞不断向顶端腔面位置移动，最终在7-8天左右脱落，从而完成肠上皮细胞更新 ，这和人体内结肠上皮的更新速度保持一致 (图 2E, 2F)。此外，研究通过使用单细胞测序技术和多重免疫组化技术对培养14天和21天的迷你结肠进行细胞类型鉴定，确认模型中包含体内结肠隐窝上皮的所有细胞类型（除Tuft cell 和misfold cell），并和体内结肠空间结构保持一致。
图 2. 迷你结肠的组织结构
迷你结肠的应用
药物毒性一直是药物研发过程中限制药物有效作用的关键因素，其中恶心，呕吐，腹痛，腹泻等是常见的胃肠道副作用，这些副作用一定程度上限制着临床药物的开发。而临床前体外毒性检测能够为临床实验提供一些可参考的数据，但是由于缺乏可靠的模型，这些数据的转化价值无法得到重视。本研究中通过使用急性髓系白血病（AML）抗癌药物对“迷你结肠”的毒性应用进行概念验证。Idasanutlin是p53抑制因子MDM2的小分子抑制剂，通过隔离MDM2和p53相互作用而稳定p53蛋白，进而激活细胞凋亡程序。在临床使用过程中发现，Idasanutlin会迅速引起腹泻，这比以往同类药物出现的更早，而原因并不十分清楚。研究人员在“迷你结肠”中加入不同剂量（1, 10, 20, 30uM）的Idasanutlin后16小时发现，已经有大量细胞凋亡（caspase3-/-7+）并脱落，屏障功能损伤（Dextran 40kDa通透性增加），肠道组织结构完整性改变 (HE and F-actin)，这些损伤随着剂量的增大变得更加严重和迅速。 这些迅速的上皮细胞脱落和肠道屏障功能损伤可能是病人用药后随即经历腹泻的原因之一。此外，这个新型模型也在肿瘤研究中进行验证，使得实时观察肿瘤发生发展过程成为可能【4,5】。
总的来说，本研究详细阐述了迷你结肠模型的构建方法，并进行了组织形态学和功能学验证，提供了科学研究和药物研发应用场景的概念验证，进一步提高了体外模型的转化可能性。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.05.007
制版人：十一
1. Kim, J., Koo, B.K., and Knoblich, J.A. (2020). Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 571–584.
2. Beaurivage,C.,Kanapeckaite,A.,Loomans,C.,et al (2020). Development of a human primary gut-on-a chip to model inflammatory processes. Sci. Rep. 10, 21475.
3. Nikolaev, M., Mitrofanova, O., Broguiere, N., et al. (2020). Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature 585, 574–578.
4. Lorenzo-Martín, L.F., Hübscher, T., Bowler, A.D. et al. Spatiotemporally resolved colorectal oncogenesis in mini-colons ex vivo. Nature 629, 450–457 (2024).
5. Lorenzo-Martín, L.F., Lutolf, M.P. Mini-colons unlock tumour development outside the body. Nat Rev Genet (2024).
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