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Basic Information

• 英文标题： A pan-cancer single-cell RNA-seq atlas of intratumoral B cells
• 中文标题：肿瘤内 B 细胞的泛癌单细胞 RNA 测序图谱
• 发表日期：14 October 2024
• 文章类型：Report
• 所属期刊：Cancer Cell
• 文章作者：Evelyn Fitzsimons | Kevin Litchfield
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610824003593

Highlights

Para_01

1. 单细胞 RNA 测序图谱识别出肿瘤内 B 细胞和浆细胞的十个聚类
2. 特定的 B 细胞亚群与免疫检查点抑制剂治疗反应相关
3. 图谱衍生的 B 细胞基因特征在空间分析中得到验证
4. 公开可用的 Shiny 工具使用户能够交互式地探索图谱

Summary

Para_01

1. 肿瘤浸润B细胞在肿瘤的发展、进展和预后中起着重要作用，但目前缺乏全面的分类系统。
2. 为了填补这一空白，我们呈现了一个涵盖大量样本队列的泛癌单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱，涉及肿瘤浸润B细胞和浆细胞。
3. 我们识别了关键的B细胞亚群特征，揭示了不同的亚群，并突显了这些细胞在肿瘤微环境中的异质性和功能多样性。
4. 我们探讨了B细胞亚群与免疫检查点抑制剂治疗反应之间的关联，发现特定亚群对总体反应的影响。
5. 此外，我们研究了B细胞和T细胞之间的相互作用，识别了特定B细胞亚群的独特配体-受体对，并进行了空间验证。
6. 这个综合数据集是一个宝贵的资源，提供了一个详细的图谱，增强了对肿瘤中B细胞复杂性的理解，并为研究和治疗策略开辟了新的途径。

Graphical abstract

Keywords

• B cells; cancer; single-cell RNA sequencing; atlas; TME; checkpoint inhibitor therapy; spatial

Introduction

Para_01

1. 肿瘤免疫微环境（TIME）对癌症发病机制、预后和治疗的贡献已经得到充分证实，尤其是在固有因素和T细胞亚群方面。
2. 然而，尽管有证据表明肿瘤浸润B细胞（TIL-Bs）在各种癌症中占显著比例，通常构成所有肿瘤浸润淋巴细胞的40%，但TIME中的B细胞区室研究较少。
3. 新兴研究突显了三级淋巴结构（TLSs）对癌症预后的重大影响，其中B细胞是关键组成部分。

Para_02

1. B细胞在癌症中发挥多重作用，影响肿瘤进展和抗肿瘤免疫反应。
2. 它们向T细胞呈递癌症抗原，通过细胞因子分泌调节T细胞功能，在肿瘤内或周围形成三级淋巴结构，并产生抗体。
3. 这些行为可以支持或阻碍癌症进展，具体取决于癌症类型和环境。
4. 例如，一些肿瘤含有抑制抗肿瘤免疫的调节性B细胞，而其他肿瘤则含有具有抗肿瘤作用的效应B细胞。
5. B细胞的预后影响存在争议，有研究将CD20+肿瘤浸润B细胞与良好预后联系起来，而其他研究则将CD20+CD138+或CD19+B细胞与不良预后相关联。
6. 类似地，产生抗体的浆细胞也可以具有抗肿瘤和促肿瘤的作用。
7. 更好地理解B细胞可能增强现有疗法。
8. 最近的研究表明，针对内源性逆转录病毒的抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性增强免疫治疗效果。

Para_03

1. B细胞研究因缺乏一个全面的分类系统而受到阻碍，该系统使用不同的表型标志来捕捉这一谱系的复杂性。
2. 虽然B细胞通常根据发育阶段、激活状态和功能进行分类，但这种方法在区分各个亚群方面存在局限性。
3. 最近的出版物旨在改进B细胞分类并探索新的亚群。
4. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步提高了我们对肿瘤内B细胞群体的理解。
5. 最近的研究发现了一种表达TIM-1的新B细胞亚群，该亚群似乎调节抗肿瘤免疫。

Para_04

1. 尽管已有多个大型泛癌种单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）T 细胞图谱，但在癌症中开发 B 细胞图谱的关注度较低。
2. 这导致了这一免疫细胞亚群的作用被低估，并且缺乏用于将新生成的 scRNA-seq 数据映射到稳健的 B 细胞亚群集合的参考数据集。
3. 近期的文献已经证明了 scRNA-seq 在探索特定癌种和外周血中肿瘤内 B 细胞异质性方面的实用性。
4. 在这项研究中，我们生成了一个全面的泛癌种 scRNA-seq TIL-B 图谱，涵盖了从广泛水平聚类到单个基因表达谱的整个谱系。

Para_05

1. 我们的分析确定了七种人类肿瘤类型中的10个不同的B细胞亚群。
2. 我们将这些亚群与已发表的检查点抑制剂（CPI）反应数据进行了关联，使用空间数据验证了特征，并开发了一个工具，供其他研究人员用于推进该领域的工作。

Results

Para_01

1. 我们从涵盖7种癌症类型的15项研究中分离出B细胞和浆细胞作为数据来源（图S1A-S1D；表S1A；图S2A）。
2. 在应用批次校正并整合数据后，我们去除了低质量的细胞（图S2B），并确定了最佳聚类数量（图S2C）。
3. 使用Seurat标准方法进行整合、聚类和差异表达分析，我们确认没有批次效应，也没有特定于研究或癌症类型的具体聚类（图S2D-S2F）。
4. 最终整合的数据集包含126,101个肿瘤浸润B细胞，分为10个聚类，排除了低质量聚类（图S2G-S2I）。
5. 图谱编制在STAR方法中描述。

Phenotypic signatures of B and plasma cells

B细胞和浆细胞的表型特征

Para_02

1. 我们采用了一种基于图的聚类方法来识别具有反复出现表型的肿瘤浸润B细胞（见STAR方法），共发现10个聚类（图1A）。
2. 聚类注释的第一步使用了如CD19和MS4A1（CD20）等经典标记物，这些标记物在B细胞发育过程中普遍存在但在浆细胞中减少。
3. CD38、JCHAIN和SDC1（CD138）等标记物在浆细胞中突出，但在早期阶段较少见。
4. 这揭示了四个B细胞聚类、四个浆细胞聚类和两个具有增殖和生发中心（GC）特征的中间聚类（图S2J和S2K）。
5. 第二步根据上调的通路（图1B）和差异表达的标记物（图1C和1D；表S1B）分配功能表型。
6. 图1E显示了不同癌症中的细胞类型分布，图S3和S4则将特征映射到癌症类型和研究。

图 1. 肿瘤内 B 细胞和浆细胞簇在图谱中的特征化
(A) 使用统一流形近似与投影（UMAP）方法对图谱中的 B 细胞子集进行可视化。
(B) 雷达图，突出显示每个簇中上调的生物学通路。
(C) 点图，显示表达特定标记的细胞比例（以大小表示）以及每个簇中这些细胞的平均表达水平（以颜色表示）。
(D) 特征图，展示 UMAP 上关键标记基因的表达情况。
(E) 堆积条形图，展示每种癌症类型中每个簇的比例。另见图 S1–S4。

Para_02

1. 第一个聚类包括了分化最早阶段的细胞，主要是表达 CD19 和 MS4A1/CD20 的初始 B 细胞，但缺乏记忆标记 CD27（图 1C）。
2. 一个关键的区分基因是 AKT 调节子和原癌基因 TCL1A（图 1D），它在过渡细胞中表达最高，在初始细胞中表达中等，在其他 B 细胞群体中缺失。
3. 该聚类特征表现为 IGHD（IgD 重链），这可能塑造了该区域，还包括淋巴结迁移标记 SELL 和 IgM Fc 受体（FCMR），后者在未成熟 B 细胞中高表达。
4. 出乎意料的是，我们观察到 FCER2（CD23）在初始 B 细胞中的高表达，通常在成熟初始 B 细胞中低表达，但在过敏等条件下上调。
5. 初始 B 细胞中 CD23 的表达在其他单细胞 RNA 测序肿瘤数据集中也有观察到，并且通过流式细胞术在外周血中也有所发现。

Para_03

1. 接下来识别出的两个簇分别是不同的记忆 B 细胞群体，两者都表达记忆标志物如 CD27，但缺乏浆细胞指标如 SDC1。
2. 第二个记忆群体的特点是表达如 TNFRSF13B（TACI，APRIL 和 BAFF 的受体）和 DUSP4（MAPK 通路的负调节因子）等标志物。
3. 值得注意的是，这个簇表达干扰素刺激基因，如 IFI6、IFI44L 和 ISG15，表明最近或正在进行干扰素刺激。
4. 由于对其功能的不确定性，这个亚群被标记为非典型记忆 B 细胞。
5. 尽管文献中提到了非典型标志物如 FCRL5 和 TBX21（T-bet），我们在非典型和浆细胞簇中都观察到了 FCRL5，而 TBX21 未被检测到，可能是因为 mRNA 表达量低。

Para_04

1. 我们接下来使用激活标志物 CD69 和 CD83 来分类高表达这些标志物的活化 B 细胞。
2. 接下来的两个聚类群包含中间群体，均表达 CD19 和 MS4A1，表明它们尚未分化为浆细胞，并且显示出高 TCL1A 表达，提示处于过渡状态。
3. 增殖性 B 细胞聚类特征表现为 MKI67、STMN1 及其他参与染色质重塑和核糖体生物发生的基因，这是细胞生长和增殖的标志。
4. 这种表型与癌症干细胞样维持和转移相关，通常在暗区 GC 细胞中观察到。
5. 然而，第二个聚类群具有如 BCL6 等特征，提示有 GC 经历（GC B 细胞）。
6. 通路分析显示抗原处理和呈递上调，反映 B 细胞在 GC 中与 T 细胞的反复相互作用。
7. 增殖性和 GC B 细胞均表达 CD38，反映它们处于活跃但短暂的状态。

Para_05

1. 确定了四种不同的浆细胞群，所有这些细胞群均缺乏 CD19、MS4A1 和 HLA 基因，但表达关键指标如 PRDM1、XBP1、CD38 和 JCHAIN，以及免疫球蛋白基因如 IGHM、IGHD、IGHA1 和 IGHG1。
2. 其中，常规浆细胞表现出高表达，而应激浆细胞则表达较低，并包括热休克蛋白（HSPs）等基因。
3. 通路分析显示，常规浆细胞中的蛋白质外运活性较高，支持其在抗体生产中的作用，而应激浆细胞则表现出 MAPK 信号传导和内吞作用的上调。
4. 值得注意的是，两个较小的簇显示出较低的浆细胞基因表达，可能表明这些是浆母细胞。
5. 一个簇表达了高水平的 IGKC，这增强了对免疫检查点阻断的反应，而另一个簇则显示出金属硫蛋白基因（包括 MT1X）的升高，这些基因在癌症和炎症性疾病中起着关键作用。

Para_06

1. 为了验证我们的聚类注释，我们进行了轨迹分析，揭示了多个分化路径（图2A）。
2. 从幼稚B细胞开始，伪时间分析显示分化通过记忆和过渡群体，最终形成浆细胞（图2B）。
3. 关键基因表达证实了这些发现，免疫球蛋白基因（IGHA1、IGHG1和IGHM）和浆细胞标记物JCHAIN的表达增加，而B细胞标记物CD19和MS4A1最初上升然后下降（图2C）。
4. 确定了三条主要的分化路径（图2D）：路径1为经典B细胞分化，路径2强调GC的关键作用，路径3展示了通过非典型记忆B细胞的替代路线。

图 2. B 细胞分化轨迹的追踪
(A) Monocle3 轨迹分析显示了图谱中的发育轨迹。
(B) Monocle3 轨迹分析，细胞根据其对应的伪时间进行着色。
(C) 关键基因在伪时间上的表达情况。
(D) 在 Monocle3 轨迹分析中识别的个体分化路径。
(E) 路径 2 和路径 3 的比较。在伪时间上比较 CSR 评分（左）和衰竭评分（右）。

Para_06

1. 为了探索路径 2 和 3，我们分析了 Ma 等人（2024）提供的伪时间过程中的类别转换重组（CSR）（即 APEX1、XRCC5 和 MIR155HG）和耗竭评分（即 PDCD1、ENTPD1 和 LAG3）（图 2E）。
2. 路径 2，最终形成 GC B 细胞，显示 CSR 评分增加，突显了这些结构在特异性抗体生产中的重要性。
3. 相反，路径 3，最终形成非典型记忆 B 细胞，显示出显著的耗竭评分增加，突显了这些细胞的功能障碍性质。

The association of B cell subsets with response to immune checkpoint inhibition

B细胞亚群与免疫检查点抑制剂反应的关系

Para_02

1. 为了探索这个图谱的生物学应用，我们使用 CIBERSORTx 分析了 B 细胞亚群与 CPI 疗法反应之间的关系，CIBERSORTx 可以从批量 RNA 测序数据中解卷积并估计细胞类型比例。
2. 我们将其应用于 CPI1000+ 队列（表 S1C），使用我们单细胞 RNA 测序图谱的参考特征矩阵（见 STAR 方法）。

Para_03

1. 分析显示，幼稚 B 细胞与总体 CPI 反应呈正相关（p = 0.036）。
2. 相反，静息记忆 B 细胞（p = 0.002）和 MT1X 高表达的浆细胞/浆母细胞（p = 0.036）与反应呈负相关（图 3A）。
3. 每种 B 细胞亚群对反应的影响因癌症类型而异（图 S5）。

图 3. B 细胞和浆细胞子集与检查点抑制剂治疗响应的关联
(A) 森林图显示了 CPI1000+ 队列中 B 细胞子集与总体响应之间的对数优势比（p < 0.05，Wald 检验）。
(B) 热图显示了 CPI1000+ 队列中与已知检查点抑制剂（CPI）响应和突变特征的 Spearman 相关性。
(C) 弦图展示了 B 细胞子集和 T 细胞子集之间的配体-受体相互作用。
(D–F) 点图展示了天真 B 细胞 (D)、静止记忆 B 细胞 (E) 和 MT1X 高表达的浆细胞/浆母细胞 (F) 与 T 细胞子集之间显著的配体-受体相互作用（p < 0.05，聚合排名阈值）。独特的相互作用以斜体突出显示。另见图 S5。

Para_03

1. 为了研究这些关联的驱动因素，我们分析了CPI1000+队列中的反应特征相关性（图3B）。
2. 总肿瘤突变负荷（TMB）与传统浆细胞（p < 0.00005，r = 0.22）和增殖B细胞（p < 0.00005，r = 0.38）之间存在显著正相关。
3. 相反，静息记忆B细胞（p < 0.05，r = −0.13）、GC B细胞（p < 0.00005，r = −0.22）、MT1X高表达的浆细胞/浆母细胞（p < 0.01，r = −0.15）和IGKC高表达的浆细胞/浆母细胞（p < 0.05，r = −0.12）表现出负相关。
4. 类似的关联也在克隆TMB中观察到，克隆TMB是CPI1000+队列中12项研究中反应的最强预测因子。
5. 增殖B细胞簇与插入缺失TMB（p < 0.00005，r = 0.22）和NMD逃逸TMB（p < 0.00005，r = 0.21）呈正相关，这表明移码突变和mRNA降解逃逸可能驱动B细胞增殖和侵袭性生长。

Para_04

1. 增殖细胞与加权基因组不稳定性指数（wGII）（p < 0.00005，r = 0.25）和基因组丢失比例（LossFrac）（p < 0.00005，r = 0.23）显示出强烈的正相关，表明高基因组不稳定性。
2. 相反，GC B 细胞与 wGII（p < 0.01，r = −0.15）和 LossFrac（p < 0.01，r = −0.15）呈负相关，这表明 GC 中存在维持基因组稳定性和限制突变的机制，例如强大的 DNA 修复、严格的细胞周期检查点以及 GC 反应的短暂性质，这些机制限制了对增殖刺激的长期暴露。

Para_05

1. 紫外线突变特征与几乎所有 B 细胞亚群相关。
2. 与初始 B 细胞（p < 0.00005, r = 0.34）、活化记忆 B 细胞（p < 0.00005, r = 0.23）、非典型记忆 B 细胞（p < 0.0005, r = 0.21）、增殖 B 细胞（p < 0.00005, r = 0.36）和常规浆细胞（p < 0.00005, r = 0.49）观察到强烈的正相关关系。
3. 这表明紫外线诱导的突变产生了免疫原性新抗原，这些新抗原激活了活跃的 B 细胞，可能增强 CPI 治疗的效果。
4. 相反，与静息记忆 B 细胞（p < 0.00005, r = −0.39）、GC B 细胞（p < 0.00005, r = −0.34）和应激浆细胞（p < 0.00005, r = −0.25）观察到负相关关系，表明免疫反应较弱，CPI 疗效降低。
5. MUC16 新抗原计数同样突显了活化 B 细胞在 CPI 反应中的作用。
6. 与 APOBEC 突变特征的对比模式可能反映了不同的突变特性和免疫反应。

Para_06

1. 高密度的肿瘤浸润 B 细胞与增加的 CXCL9 产生和 CD8+ T 细胞相关，这在我们的数据中得到了反映。
2. 非典型记忆 B 细胞（p < 0.00005）、常规浆细胞（p < 0.0005）和 MT1X 高表达的浆细胞/浆母细胞（p < 0.00005）与 CD8A 和 CXCL9 基因特征、T 细胞炎症基因表达谱以及 CD274（PD-L1）的关系最为密切。
3. 这些 B 细胞群体可能驱动一个促进炎症的肿瘤微环境，增强 T 细胞活化，这对于 CPI 的效果至关重要。

The crosstalk between B cell subsets and T cells

B细胞亚群与T细胞之间的相互作用

Para_02

1. B 细胞亚群之间的相关性表明了一种协调的关系，支持了三级结构包含多种细胞群体的观点。
2. TIL-Bs 在组织化的三级淋巴结构（TLS）、免疫热点和聚集体中与 T 细胞和其他免疫细胞共定位。
3. 最近的研究表明，TLS 与 CPI 治疗反应之间存在强烈的关联。
4. 我们使用配体-受体分析研究了 B 细胞亚群与 T 细胞亚群之间的相互作用，这些 T 细胞亚群来自同一患者，在我们小组制作的另一个图谱中被识别（未发表）（图 3C-3F；表 S1D）。
5. 大多数患者未经治疗，观察到的相互作用代表了一般的 B/T 细胞相互作用，而不是治疗引起的相互作用。

Para_03

1. 揭示了一个高度互联的 B 细胞和 T 细胞相互作用网络（图 3C）。
2. 静息记忆 B 细胞与耗竭 T 细胞之间表现出广泛的交叉对话，表明功能失调的 T 细胞与 B 细胞之间的相互作用可能不足以引发 B 细胞活化。
3. 相反，CD8+ 效应记忆 T 细胞与初始 B 细胞之间的相互作用数量表明其在抗原呈递和细胞因子信号传导中的作用，有助于初始 B 细胞的活化和成熟。
4. 值得注意的是，发现生发中心 B 细胞与多种 T 细胞亚群之间存在显著的相互作用，特别是 CD4+ 辅助 T 细胞和 CD4+ 调节 T 细胞，这对生发中心过程至关重要。

Para_04

1. 我们专注于与 CPI 疗法总体反应相关的子集在 CPI1000+ 队列中的表现。
2. 有趣的是，尽管它们与 CPI 反应的关系相反，我们观察到 T 细胞与初始细胞（图 3D）或静息记忆 B 细胞（例如，CXCL13/CXCR5）（图 3E）之间存在多个共同的通信轴。
3. 这表明这些相互作用可能很重要，但单独不足以决定 B-T 细胞串扰对 CPI 反应的影响。

Para_05

1. 在初始 B 细胞和 T 细胞亚群之间发现了四种显著且独特的配体-受体相互作用（图 3D）。
2. TNSFS13B（BAFF）是一种 B 细胞成熟因子，激活 CD40+ B 细胞，促进抗原向 CD4+ T 细胞的呈递、Th1 和记忆 T 细胞的分化以及抗肿瘤免疫，尽管 T 细胞内在的 CD40 信号传导了解较少。
3. 淋巴细胞上的 SEMA4D（CD100）与 B 细胞上的 CD72 相互作用，导致 T 细胞增殖。
4. 巨噬细胞和树突状细胞上的 LGALS1（半乳糖凝集素-1）与 T 细胞上的 CD69 相互作用，偏向 Th 细胞分化，但类似 B-T 细胞相互作用的研究有限。
5. 最后，在调节性 T 细胞（Tregs）和 CD8+ 效应记忆 T 细胞（CD8 Tem）上的 HLA-A 与 B 细胞上的 APLP2 之间发现了一种相互作用。

Para_06

1. 静息记忆 B 细胞与 T 细胞表现出五种独特的配体-受体相互作用（图 3E）。
2. CD4 辅助 T 细胞上的 TNFSF13B 与静息记忆 B 细胞上的 TNFRSF13B (TACI) 相互作用，对 B 细胞稳态和成熟至关重要。
3. CD8 Tem 细胞上的 SPON2 与静息记忆 B 细胞上的 ITGB1 相互作用。
4. ITGB1 还与 CD4 中心记忆 T 细胞和 CD8 效应 T 细胞上的 LGALS1 相互作用，这与细胞增殖和迁移有关，半乳凝素-1 被认为是治疗靶点。
5. 各种 CD4 和 CD8 T 细胞上的 CD28 与静息记忆 B 细胞上的 CD86 结合，对特异性抗原 T 细胞活化以及抗原预处理的 T 辅助细胞和 B 细胞之间的相互作用至关重要。
6. 最后，CD4 Treg 和 CD4/CD8 终末耗竭 T 细胞上的 CD70 与静息记忆 B 细胞上的 TNFRSF13B 相互作用。

Para_07

1. 关于高表达 MT1X 的浆细胞/浆母细胞，最强的独特配体-受体相互作用是 CD8 效应 T 细胞和记忆细胞上的 CCL5 与 SDC1（图 3F）之间的相互作用，这种相互作用已被证明促进肿瘤细胞迁移。
2. 另一种独特相互作用 TIMP1/CD63 通过整合素信号调节来调控细胞存活和极化。

Validation of markers and interactions spatially in tumor tissue

在肿瘤组织中空间验证标志物和相互作用

Para_02

1. 为了验证我们图谱中确定的关键标志物和相互作用，我们分析了公开可用的 CosMx SMI 人类非小细胞肺癌（RNA）数据集（Nanostring）。
2. 我们观察到，在浆细胞附近肿瘤细胞的比例与 B 细胞附近的比例存在显著差异，这表明属于浆细胞系的细胞向肿瘤床的浸润增加（图 4A）。

图 4. 关键标记的空间验证
(A) 肿瘤细胞在 100 个最近邻居中的比例，比较 B 细胞和浆细胞区域（p < 0.001，Welch's t 检验）。
(B) 每个空间区域内 B 细胞和浆细胞的比例（p < 0.001，Welch's t 检验）。
(C) CosMx 数据集中肺部样本 5 Rep 1 中所有细胞类型之间的细胞邻近富集得分。
(D) CosMx 数据集中所有注释的细胞类型和空间区域的可视化。
(E) 使用图谱中识别的特征计算 UCell 得分：CD19、MS4A1、SELL 和 TCL1A（天真 B 细胞）；CD19、MS4A1、CD27 和 HLA-DPB1（记忆 B 细胞）；JCHAIN、IGHG1、MT1X 和 MT2A（MT1X 高表达的浆细胞）。
(F) 基于 10 个最近邻居的空间网络。另见图 S6。

在 (A) 和 (B) 中的箱线图中，箱体范围为第 25 到第 75 百分位数，中线表示中位数，须状线延伸到 1.5 倍的四分位距 (IQR)。

Para_02

1. 生态位组成分析证实了这种空间分布；淋巴结构中的 B 细胞比例较高（p < 0.001），而肿瘤-基质边界富含浆细胞（p = 0.005），且 B 细胞较少（图 4B）。
2. 一个特定的基质生态位，称为浆细胞富集型，由 33.7% 的浆细胞系细胞组成。
3. 空间邻近性分析显示 B 细胞与幼稚和记忆 T 细胞亚群相邻，而浆细胞则更多地与调节性 T 细胞共定位（图 4C）。
4. 这种方法还证实了浆细胞系细胞比 B 细胞更接近肿瘤细胞。

Para_03

1. 对这个数据集中注释的细胞群体的评估展示了代表性晚期肺腺癌样本中细胞类型的异质性和空间分布模式（图4D）。
2. 我们专注于淋巴结构中的B细胞和间质中的浆细胞，以更好地理解它们的表型及其与CD4和CD8 T细胞的相互作用。
3. 通过整理每个簇的关键标志物，我们生成了代表与CPI反应相关的亚群的复合特征，并相应地对每个细胞进行评分（图4E）。
4. 这些特征区分了幼稚B细胞和记忆B细胞，但在进一步的亚聚类方面分辨率有限。

Para_04

1. 最后，我们探讨了每个子集特有的配体-受体相互作用（图4F）。
2. K最近邻空间分析证实了TACI+ CD4+ T细胞与幼稚/记忆B细胞之间的细胞间通讯，以及肺癌中浆细胞与CD4 T细胞之间的TIMP1:CD63轴。
3. 图谱衍生的特征可以应用于单细胞空间转录组学，并扩展用于低分辨率空间数据集，以在各种癌症类型中可视化空间模式（图S6）。

An online reference map for TIL-B annotation

TIL-B注释的在线参考图

Para_02

1. 这项工作的主要目标是为研究肿瘤内 B 细胞的研究人员创建一个易于访问的数据集。
2. 开发了一个公开访问的 Shiny 工具，涵盖了整个图谱，允许用户分析数据集，关注感兴趣的基因，并将其与自己的发现进行比较（图 S7）。
3. Shiny 工具可以通过 https://tigilab.shinyapps.io/shinyapp_labelled/ 访问。

Discussion

Para_01

1. 针对癌症中体液免疫日益增长的兴趣，我们的研究表征了多种癌症类型中的肿瘤内 B 细胞和浆细胞，识别出十个具有不同作用于肿瘤动态的独特亚群。
2. 我们发现某些 B 细胞亚群与 CPI 反应之间存在关联，这与文献中显示这一谱系的重要性一致。
3. 较高的初始 B 细胞频率与更好的反应相关，而通常与改善反应相关的静息记忆 B 细胞却表现出相反的效果，表明 B 细胞激活水平在预测治疗结果中至关重要。
4. B 细胞与突变特征（例如 TMB、UV 和 MUC16）以及 T 细胞炎症谱之间的相互作用突显了肿瘤微环境中的复杂相互作用。
5. APOBEC 突变特征与活化 B 细胞之间的不良相关性可能表明过度活跃的突变过程导致免疫耗竭，从而降低 CPI 的疗效。

Para_02

1. 尽管研究有限，但研究表明更高的 MT1X 表达与较差的预后有关，因为其在免疫调节中的作用。
2. 非典型记忆 B 细胞虽然常被认为是功能失调的，但可以与辅助 T 细胞一起产生大量 CXCL9。
3. 研究支持 MT1X 与 CD8+ T 细胞之间的相关性，以及浆细胞与 CD8+ T 细胞/CXCL9 之间的相关性，影响 PD-L1 阻断的疗效。
4. 特定 B 细胞亚群在反应中的作用仍有争议，B 细胞活化水平可能是关键决定因素。

Para_03

1. 我们还探讨了肿瘤微环境中 B 细胞和 T 细胞之间的相互作用，确定了涉及的具体配体-受体对。
2. 这些相互作用描绘了总体免疫动态，研究这些相互作用在治疗过程中如何变化可以为响应和耐药机制提供有价值的见解。
3. CD72 已被证明可以负向调节 B 细胞反应，但其与 SEMA4D 的相互作用可能抵消这种抑制并恢复 B 细胞功能。
4. 研究表明，半乳凝素在 B 细胞发育、信号传导和相互作用中起作用，半乳凝素-1 可诱导 CD69 上调，后者对炎症反应具有调节作用。
5. B 细胞上的 HLA-A 和 APLP2 的相互作用令人感兴趣，可能对 CPI 反应产生影响，特别是在幼稚 B 细胞的背景下。
6. 静息记忆 B 细胞上 CD70 和 TNFRSF13B（TACI）的相互作用未得到当前文献的广泛支持；CD70 通常与 CD27 相互作用，而 TACI 是 BAFF 和 APRIL 的受体。
7. 然而，肿瘤环境相互作用的复杂性表明需要进一步研究。

Para_04

1. 我们验证了这些配体-受体相互作用的空间分布，以证明肿瘤微环境中 B 细胞和 T 细胞之间的相互作用。
2. 我们的分析揭示了富含 B 细胞的淋巴结构，与散在的浆细胞相比。
3. 这些结构对免疫治疗具有重要意义，可能通过调节免疫景观影响治疗反应。
4. 了解这些生态位内免疫细胞的空间分布和相互作用，可能会导致更精准的治疗策略。

Para_05

1. 尽管对肿瘤微环境中 B 细胞的兴趣日益增加，但关于亚群分类的争议仍然存在。
2. 我们使用了"非典型记忆 B 细胞"这一术语来描述具有独特特征的记忆 B 细胞，尽管这一术语的应用不一致，通常与"耗竭"同义，描述慢性刺激和正常功能的抑制。
3. 识别非典型 B 细胞具有挑战性，因为依赖于排除性表型鉴定，而分类进一步因文献中的众多别名而复杂化。
4. 为了完全理解它们在肿瘤微环境中的作用，需要改进分类和功能验证。

Para_06

1. 最近关于 B 细胞的研究提高了细胞识别的准确性。
2. 例如，Ma 等人确定了高表达 DUSP4 的非典型 B 细胞，这与我们的发现一致，同时还使用 SUGCT、LMO2 和 MARCKSL1 识别了生发中心 B 细胞（GC B 细胞）。
3. 他们的数据集使更精细的聚类和不同 GC 亚群的识别成为可能。
4. 类似地，我们图谱中的活化 B 细胞对应于 Ma 等人描述的三种活化 B 细胞簇的混合体。
5. 他们还确定了表达 HSPA1A、HSPA1B 和 DNAJB1 的 MT1X+ 和应激细胞。
6. 我们的轨迹分析揭示了通过生发中心 B 细胞或非典型记忆 B 细胞的相似分化路径。
7. 与 Ma 等人不同，他们将 B 细胞和浆细胞分开，我们追踪了整个分化途径直至浆细胞。
8. 这种一致性验证了我们的发现，并展示了整合多个研究的数据以改进 B 细胞分类的实用性。
9. 最后，我们制作了一个公开可用的工具来访问该图谱，并鼓励研究人员使用它来推进自己的研究。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_07

1. 需要注意几个限制。
2. 所呈现的数据主要是描述性的，需要前瞻性实验验证。
3. 这项工作严重依赖于源数据集的原始注释，这些注释可能存在不准确性。
4. 响应数据是从外部数据集外推而来的，可能无法完全捕捉到个体患者的反应。
5. 泛癌症方法可能分析有限，因为免疫检查点抑制剂（CPI）的反应在不同癌症类型之间可能有所不同。
6. 低分辨率或转录组覆盖范围有限的空间技术可能会阻碍罕见 B 细胞亚群的识别。
7. 未来的工作应集中在识别已知具有肿瘤促进作用的 B 调节细胞，这可能需要进一步聚类和评估正常组织数据集。
8. 对类别转换的免疫球蛋白群体进行子分析可能为进一步了解浆细胞群体的作用提供更多的见解。

Resource availability

Lead contact

主要联系人

Para_01

1. 进一步的信息和数据共享请求应直接联系主要联系人，凯文·利奇菲尔德博士（[email protected]）。

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究没有生成新的独特试剂。

Data and code availability

数据和代码可用性

• 该图谱的 Seurat 对象已存放在 Zenodo 上。访问编号列在关键资源表中。该图谱的 Shiny 细胞应用程序已存放在 shinyapps.io 上，并且 URL 已在关键资源表中提供。本文分析了现有的、公开可用的数据。数据集的来源列在关键资源表中。

• 所有原始代码已在出版之日存放在 GitHub 上，并公开可用。URL 已在关键资源表中提供。

• 重新分析本文报告的数据所需的所有其他信息，可应要求从主要联系人处获得。

Acknowledgments

Para_01

1. K.L. 受到了英国医学研究委员会（MR/V033077/1）、Rosetrees 信托和 Cotswold 信托（A2437）以及黑色素瘤研究联盟和癌症研究英国（C69256/A30194）的支持。
2. J.L.R. 受到了英国研究与创新未来领袖奖学金（MR/W011786/1）、CRUK 早期检测奖（EDDPJT-Nov22/100042）、UCL NIHR 生物医学研究中心资助（BRC907/CN/JR/101330）、CRUK CoL 早期检测发展奖、癌症早期检测联盟奖（ACEPGM-2022/10000）、CRUK 预防生物学奖（PRCBTP-Nov23/100012）以及来自 MRC DTP（A.E.，MR/N013867/1）和 CRUK 的博士生奖学金的支持。
3. E.F. 受到了癌症研究英国非临床学生奖学金（CANTAC721\100022）的支持。
4. M.A. 受到了伦敦市临床学术培训计划（第三年，SEBSTF-2021\100007）的支持。
5. 我们特别感谢 Jun Murai 分享了用于数据整合的脚本。

Author contributions

Para_01

1. E.F. 进行了图谱构建并撰写了手稿。
2. D.Q. 进行了数据整理并编辑了手稿。
3. A.E. 协助撰写了手稿。
4. E.F.、D.Q. 和 A.E. 进行了分析并制作了图表。
5. K.T.、S.G. 和 M.A. 协助进行了分析。
6. K.L. 和 J.L.R. 提供了项目的监督和管理。

Declaration of interests

Para_01

1. K.L. 有以下披露（与本工作无关）：关于插入缺失负担和 CPI 反应的专利正在申请中，关于 ctDNA 最小残留疾病检测方法的专利；从 Roche Tissue Diagnostics 和 Ellipses Pharma 获得演讲费；从 CRUK TDL/Ono/LifeArc 联盟和 Genesis Therapeutics 获得研究资金；并在 Monopteros Therapeutics、Kynos Therapeutics、SAGA Diagnostics 和 Tempus Labs, Inc. 担任顾问。此外，与本工作无关，K.L. 目前受雇于 Isomorphic Labs。
2. J.L.R. 有以下披露（与本工作无关）：已提交癌症早期检测的专利，并在 Achilles Therapeutics plc 担任顾问。

STAR★Methods

Key resources table

关键资源表

Method details

方法细节

Extraction of B and plasma cells from individual datasets

从个体数据集中提取B细胞和浆细胞

Para_01

1. 图集共纳入了15项研究，每项研究采用了不同的方法，并提供了有价值的元数据，包括细胞水平的注释。
2. 数据编纂策略如图 S1C 所示。
3. 原始计数来自基因表达综合数据库（GEO）：GSE114727（Azizi 等人），GSE131907（Kim 等人），GSE123139（Li 等人），GSE178341（Pelka 等人），GSE121638（Borcherding 等人），GSE148071（Wu 等人），GSE123813（Yost 等人），GSE169246（Zhang 等人），GSE127465（Zilionis 等人）。
4. 序列读取档案库：SRZ190804 提供了一个包含 Krishna 等人原始计数的 Seurat 对象。
5. Maynard 等人的原始计数从 https://github.com/czbiohub-sf/scell_lung_adenocarcinoma 下载。
6. Qian 等人的计数矩阵从 http://blueprint.lambrechtslab.org 下载。
7. Braun 等人数据集的原始计数矩阵来自出版物的补充信息。
8. 单细胞门户（https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP1288/tumor-and-immune-reprogramming-during-immunotherapy-in-advanced-renal-cell-carcinoma#study-summary）用于访问 Bi 等人数据集的处理数据。
9. Chan 等人的数据通过人类肿瘤图谱网络（HTAN）数据门户 https://data.humantumoratlas.org/ 获取。
10. 表 S1 提供了图集中每项研究的详细信息。

Para_02

1. 这些元数据文件被合并，并对变量名称进行了调整以确保一致性。
2. 鉴于这些研究经过了严格的同行评审过程，且作者对数据有全面的了解，我们依赖原始注释来识别和提取 B 细胞和浆细胞。
3. 然而，在整合和聚类过程中，我们发现某些注释可能不完全准确，并且存在其他细胞类型污染的潜在风险。
4. 为了确保数据的完整性并建立对细胞分类为 B 细胞或浆细胞的信心，我们删除了两个细胞数量较少（<2000）的聚类，以及另外两个表现出明显标记的聚类，这些标记表明 T/B 细胞错误注释/双峰和 MNP/B 细胞错误注释/双峰（图 S2G–S2I）。

Quantification and statistical analysis

量化和统计分析

Data pre-processing, integration and batch correction

数据预处理、集成和批次校正

Para_01

1. 原始计数矩阵通过 Seurat 包版本 4.3.0 和 5.1.0 进行合并和分析，并根据质量控制指标进行质量控制；总 UMI 数量、总表达基因数量和线粒体基因表达百分比。
2. 具体来说，低质量细胞通过排除少于 200 个 UMI 和少于 300 个表达基因的细胞条形码被过滤掉，并且线粒体特征被回归出去。
3. 使用 Seurat 包中的既定方法进行了整合和批次校正，遵循标准协议。
4. 使用 scib-metrics Python 包 v0.5.1 进行整合方法的基准测试（https://scib-metrics.readthedocs.io/en/stable/）表明，典型相关分析（CCA）是最佳方法（图 S2D）。

Para_02

1. 在整合和聚类之前，原始计数数据经过了 SCTransform（SCT）归一化处理，以优化后续聚类分析中生物信号的分离。
2. 对整合变换后的表达矩阵进行了主成分分析（PCA），并用于基于图的聚类和使用均匀流形近似和投影（UMAP）进行降维。
3. 使用 FindClusters 函数在分辨率范围为 0-2.5 的情况下识别聚类，并根据肘部图选择了最终分辨率为 0.2。

Annotation

注释

Para_01

1. 聚类注释主要通过针对感兴趣的关键标志物进行彻底和全面的文献搜索来完成，并使用 Seurat 函数 FindAllMarkers 进行严格的差异表达分析（表 S1B）。
2. 为了增强注释的可靠性，还使用 SingleR 进行了额外验证，利用来自人类原代细胞图谱的细胞表达谱。

Pathway analysis

通路分析

Para_01

1. 使用 fsgea R 包进行了通路分析，通过识别每个聚类中差异表达基因顶部共享的通路来选择关键通路。
2. 差异表达分析中组间平均表达量的 log2 折变被用作基因排名指标，并使用 1000 次置换进行了预排序基因集富集分析。
3. 使用 MSigDB v7.5 中的 KEGG 数据集来识别富集通路，调整后的 p 值 <0.05 被认为是显著的。

Trajectory analysis

轨迹分析

Para_01

1. 使用 R 包 Monocle3（版本 1.3.1）来定义计算推断的伪时间轨迹。
2. 使用 as.cell_data_set 函数将 Seurat 对象导入到 Monocle 中。
3. 通过使用 order_cells 函数将幼稚 B 细胞设置为轨迹的根节点，以按伪时间顺序排列细胞。
4. 使用 plot_genes_in_pseudotime 函数来可视化基因在伪时间上的动态变化。
5. choose_graph_segments 函数可以探索从幼稚 B 细胞起源的各种分化分支。
6. 随后，使用 AddModuleScore 函数计算每个识别分支上的基因集得分。
7. 平滑趋势图用于描绘每个分支伪时间上基因集的动态表达得分。

Association with CPI response

与消费者价格指数（CPI）反应的关联

Para_01

1. CPI1000+队列是一个规模较大且已发表的患者数据集，这些患者接受了免疫检查点抑制剂治疗，该队列被用于建立本图谱中识别的B细胞和浆细胞簇与CPI反应之间的关联。
2. 这包括利用一个包含938名患者的每百万转录本（TPM）标准化的批量表达矩阵，每个患者都配对了相应的反应标签。
3. 该队列包括来自多个临床和学术试验的数据，这些试验的测序数据和临床数据随后进行了统一。
4. 该队列中的大多数样本是在治疗前采集的，仅研究了一个时间点。
5. CPI1000+队列总结见表S1C。

Para_02

1. 为了估计 CPI1000+ 队列中的批量 RNA-seq 数据中 10 个 B 细胞簇的比例，我们使用了 CIBERSORTx v1.0556（https://cibersortx.stanford.edu）。
2. 这种方法使我们能够通过从 B 细胞和浆细胞图谱中创建参考签名矩阵来计算每个 B 细胞亚群在 RNA-seq 数据中的比例。
3. CIBERSORTx 在执行时使用了 S 模式批处理校正，用于来自单细胞 RNA-seq 图谱的签名，并且禁用了批量 RNA-seq 的分位数归一化，所有其他参数均设置为默认值。
4. 采用逻辑回归模型评估 ICB 反应与每个 B 细胞簇比例之间的关联，并使用森林图可视化各个 B 细胞簇的对数优势比（log ORs）（p < 0.05，Wald 检验）。
5. 为了在特定癌症类型中评估这些关联，使用了 Wilcoxon 检验，并使用箱线图显示数据（图 S5）。

Para_03

1. 为了研究使用 CIBERSORTx 计算的 B 细胞和浆细胞簇比例与 CPI 反应特征之间的相关性，进行了 Spearman 相关分析，比较了 CPI1000+ 数据集中反应者和非反应者。
2. 为了确保统计分析的稳健性，所有 p 值均进行了假发现率（FDR）校正。

Ligand-receptor analysis

配体-受体分析

Para_01

1. 我们小组的一个未发表图谱用于评估 B 细胞亚群与 T 细胞之间的细胞间通讯。
2. 选择包含 B 细胞和 T 细胞的样本进行分析。
3. 使用 LIANA113 R 包来研究这些相互作用。
4. LIANA 利用多个专家策划的配体-受体数据库的共识资源，包括 CellPhoneDB、CellChat、ICELLNET、connectomeDB2020 和 CellTalkDB，运行各种方法，包括 natmi、connectome、logfc、sca、cellphonedb 和 call_cellchat。
5. 基于配体-受体对的表达预测细胞簇之间的潜在相互作用，并通过置换测试确定显著性。
6. LIANA 为不同方法的结果提供了综合共识排名，使用了 RobustRankAggreg (RRA) 方法的重新实现。
7. 使用综合排名阈值（<0.05）过滤相互作用，该值用于可视化作为 p 值。
8. 对于点图，SingleCellSignalR 的 LRscore 表示配体和受体的表达量，而 NATMI 特异性权重评估了相互作用对配体和受体细胞类型的特异性。

Spatial validation of key markers

关键标记的空间验证

Para_01

1. 为了对本图谱构建的特征进行空间分析，我们利用了 NanoString 提供的公开可用的 CosMxTM SMI FFPE 数据集。这个数据集捕捉了 8 个肺癌样本中的空间基因表达，涵盖了 771,236 个细胞中的 960 个基因。

Para_02

1. 对于下游分析，我们在 R 中使用了 Giotto 包（v4.0.9）。
2. 基于现有的元数据和空间网络，我们调查了属于 B 细胞区室的细胞（特别是肿瘤细胞作为浸润的代理）的前 100 个最近邻。
3. 显著性通过 Welch’s t 检验计算。
4. 为了测试 B 细胞和浆细胞区室中细胞的空间分布，我们通过执行双侧 Welch’s t 检验来研究 CosMx 数据集中定义的生态位。
5. 少于 50 个细胞的生态位被手动移除。

Para_03

1. 为了更好地理解细胞间相互作用，我们使用了 Giotto 包中的 cellProximityEnrichment() 函数，该函数采用随机置换策略来识别在空间上优先邻近定位的细胞类型。
2. 所得的 PI 值定义为 log2 折叠变化 x -log10（调整后的 p 值），由 cellProximityEnrichment() 函数模拟得出。

Para_04

1. 此外，为了可视化感兴趣的细胞和生态位，我们专注于肺5复制体1的6个视场（FOVs），代表晚期肺腺癌。
2. 为了评估我们的特征，我们使用了面板中存在的以下标记计算了一个UCell117得分：CD19、MS4A1、SELL、TCL1A（幼稚B细胞）；CD19、MS4A1、CD27、HLA-DPB1（记忆B细胞）；JCHAIN、IGHG1、MT1X、MT2A（高MT1X浆细胞）。
3. 基于10个最近邻创建的空间网络允许确认由我们的单细胞RNA测序图谱突出显示的空间受限的配体-受体相互作用。

Para_05

1. 对于 Visium 全转录组分析，我们使用了两个公开可用的 10x Genomics 数据集，分别是乳腺癌（https://www.10xgenomics.com/datasets/human-breast-cancer-ductal-carcinoma-in-situ-invasive-carcinoma-ffpe-1-standard-1-3-0）和肺癌（https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-libraries-of-human-lung-cancer-if）。
2. 为了创建扩展特征，我们专注于图谱中的癌症类型特异性子集（肺和乳腺），分别对每种癌症类型进行差异表达分析。
3. 然后，我们将每种癌症类型的前 10 个差异表达基因与图谱中总体的前 10 个基因结合，并手动排除可能与其他细胞类型混淆的基因。
4. 我们筛选出包含 CD19/MS4A1 转录本的点以专注于 B 细胞，以及包含 JCHAIN 转录本的点以专注于浆细胞。
5. 然后，我们使用 SpatialFeaturePlot() 函数（Seurat v5.1.0）可视化经典标记物和扩展特征。

Shinytool creation

Shinytool 创作

Para_01

1. 该图集通过使用默认设置的 ShinyCell R 包开发的交互工具得到了增强。
2. 参见图 S7。

Supplemental information

Para_01

1. 下载：下载 Acrobat PDF 文件（29MB）文档 S1。附图 S1-S7。
2. 下载：下载电子表格（5MB）表 S1。与图 1、3、S1、S5 和 STAR 方法相关的图谱分析附加信息。（A）包含在图谱中的数据集；（B）差异表达基因；（C）CPI1000+ 数据集；（D）配体-受体分析。
3. 下载：下载 Acrobat PDF 文件（36MB）文档 S2。文章加补充信息。