基于血清生物标志物变化的蒙古扁桃石油醚提取物防治肝纤维疾病进展动态研究

肝纤维化是炎症等刺激器官，实质细胞发生坏死、组织内细胞外基质（ extracellular matrix ， ECM ） 异常增多和过度沉积的复杂动态可逆性病理过程 ^[1] 。 中药具有多环节、多途径、多靶点的作用特点，在治疗脏器纤维化方面有独特优势。因此，挖掘天然有效药物，对治疗肝纤维化有重要意义。代谢组学技术在方法学上具有集融整性、动态、综合、分析于一体的特点，与中医药整体观相吻合，广泛应用于中医药疗效评价与机制研究 ^[2-4] 。

蒙古扁桃 Amygdalus mongolica (Maxim.) Ricker 蒙名为乌兰 - 布衣勒斯，是蒙古高原特有的阿拉善荒漠种，属蔷薇科扁桃属旱生落叶灌木 ^[5] 。蒙古扁桃作为民间传统药材，其种仁代替中药“郁李仁”入药，性平、味苦，能润燥滑肠、止咳化痰、利尿，主治咽喉干燥、干咳、支气管炎、阴虚便秘、水肿等症 ^[6-7] 。课题组前期对蒙古扁桃化学成分和药理作用进行了基础研究，从其种仁中分离发现不饱和脂肪酸、苦杏仁苷、有机酸、黄酮类、多糖类、生物碱类等多种成分 ^[8-13] 。蒙古扁桃石油醚提取物作为其有效组分被证实具有良好的调血脂、抗脂质过氧化、改善肝肾纤维化作用 ^[14-16] 。由于肝纤维化的发生发展为动态进展式病程，因此研究疾病不同阶段的生物标志物动态变化对药物的药效评价及机制研究具有重要意义。目前尚缺乏蒙古扁桃石油醚提取物对肝纤维疾病发展的动态研究，且其潜在作用机制不明。

课题组前期通过病理组织、氧化指标、血清肝纤维化四项对蒙古扁桃石油醚提取物进行了药效学评价，并初步证实其具有抗肝纤维化作用 ^[15] 。本研究在此基础上，运用代谢组学技术，探究其对肝纤维化模型大鼠不同阶段血清代谢谱、潜在生物标志物的种类和含量的影响，进一步从代谢角度揭示蒙古扁桃提取物抗肝纤维化的作用机制，为寻找抗肝纤维化的有效药物提供科学依据，也为蒙古扁桃药理作用的深入研究和中蒙药资源的开发提供理论基础和实验指导。

1 材料

1.1 药物

蒙古扁桃药材采自阿拉善雅布来戈壁，经包头医学院药学院石松利教授鉴定为蔷薇科桃属扁桃亚属植物蒙古扁桃 A. mongolica (Maxim.) Ricker 的 干燥成熟种子；水飞蓟素胶囊（批号 131102819 ，规格 14 mg/ 粒）购自德国马博士大药厂。

1.2 试剂

四氯化碳（ carbontetrachloride ， CCl ₄ ，批号 20091217 ）购自天津市北方天医化学试剂厂；特级初榨橄榄油（批号 20150123 ）购自山东鲁花集团有限公司；羧甲基纤维素钠（批号 20150912 ）购自天津市凯通化学试剂有限公司；乙腈（色谱级）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；亮氨酸脑啡肽购自美国 Sigma-Aldrich 公司；纯净水购自美国 Sigma 公司；甲酸（色谱级）购自美国 Dikma Technologies 公司。

1.3 动物

SPF 级 SD 雄性大鼠， 4 周龄，体质量 170 ～ 200 g ， 48 只，购自北京大学医学部（实验动物科学部），许可证号 SCXK （京） 2011-0012 。 饲养条件：实验室温度 23 ～ 25 ℃，相对湿度（ 50 ± 5 ） % 。动物实验已获得内蒙古科技大学包头医学院医学伦理委员会批准（批准号 20160310 ）。大鼠最终采取 sc 水合氯醛麻醉处死。

1.4 仪器

DZW-8-8 型水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）； RE-52A 型旋转蒸发仪、 SHZ-D （ III ）循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）； TGL-16M 型高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）； MH-250 型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）； AcquityTM UPLC 超高液相色谱仪、四极杆 - 飞行时间串联质谱仪（ Q-TOF/MS ，美国 Waters 公司）； KDC-160HR 高速冷冻离心机（科大创新有限公司）。

2 方法

2.1 蒙古扁桃石油醚提取物的制备

取蒙古扁桃种仁，碾碎后用回流煎煮法以 95% 乙醇 90 ℃提取 2 次， 70% 乙醇 90 ℃提取 1 次，每次 2 h ，回收溶剂浓缩成稠浸膏制备总提物，再用石油醚进行萃取，浓缩挥干称重，得石油醚萃取物，得率为 13.7% 。经成分含量分析，蒙古扁桃石油醚提取物主要含脂肪酸类化合物，其中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的 73.20% ，主要包括 28.87% 油酸、 38.69% 亚油酸；饱和脂肪酸以棕榈酸为主，其质量分数为 19.66% ^[14] 。

2.2 肝纤维化模型制备 、 分组和给药

大鼠肝纤维化模型制备方法参照文献方法 ^[17] ，依据石油醚提取物有效剂量，大鼠适应 1 周后，按体质量随机分为对照组，模型组，水飞蓟素（ 50 mg/kg ，水飞蓟素溶于 0.5% 羧甲基纤维素钠配制成质量浓度为 10 mg/mL 的溶液）组，蒙古扁桃高、中、低剂量（ 1.75 、 1.25 、 0.75 g/kg ，蒙古扁桃石油醚提取物溶于 0.5% 羧甲基纤维素钠分别配制成质量浓度 为 0.35 、 0.25 、 0.15 mg/mL 的溶液）组，每组 8 只 ^[14-15] 。 除对照组大鼠 sc 橄榄油外，其余各组大鼠于腹部 sc40% CCl ₄ 橄榄油溶液（首次 5 mL/kg ，之后 3 mL/kg ）， 2 次 / 周，持续 8 周。造模同时各给药组大鼠 ig 相应药物（ 5 mL/kg ），模型组和对照组 ig 等体积羧甲基纤维素钠溶液。

2.3 样本收集

大鼠分别于实验第 2 、 4 、 6 、 8 周眼眶静脉取血，置于分离胶促凝管中，离心取上清，于 −80 ℃保存，用于血清代谢组学研究。

2.4 血清代谢组学研究

2.4.1 色谱条件 AcquityUPLC BEH C ₁₈ 色谱柱（ 100mm × 2.1 mm ， 1.7µm ）；流动相 A 为 0.1% 甲酸乙腈，流动相 B 为 0.1% 甲酸水溶液，梯度洗脱： 0 ～ 15 min ， 2% ～ 100% A ； 15 ～ 17 min ， 100%A ； 17 ～ 18min ， 100% ～ 2%A ； 18 ～ 20 min ， 2% A ；柱温为 40 ℃；体积流量为 0.4 mL/min ；进样量为 2 µL 。

2.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ ESI ），采用正、负离子 W 模式检测，毛细管电压为 1300 V （ ESI ^＋ ）、 1500 V （ ESI ⁻ ）；样品锥孔电压为 60 V （ ESI ^＋ ）、 70 （ ESI ⁻ ）；离子源温度为 110 ℃；脱溶剂温度为 350 ℃；脱溶剂氮气体积流量为 750 L/h ；锥孔气体积流量为 20 L/h 。锁定质量溶液，采用美国 Waters 公司 LockSprayTM 校正系统进行在线质量校正。亮氨酸脑啡肽准分子离子峰为 [M ＋ H] ^＋ ＝ 556.277 1 、 [M － H] ⁻ ＝ 554.261 5 ，锁定质量浓度为 1 ng/mL ，体积流量为 30 μL/min 。扫描方式为全扫描，质量扫描范围为 m / z : 100 ～ 1500 。

2.4.3 多元数据分析 将各组血清样品测得的质谱数据导入 Waters Progenesis QI 2.3 软件进行分析。每个离子的强度相对于总离子数进行归一化，并生成数据矩阵，包括保留时间、质荷比、归一化后的峰面积。再使用 Waters EZinfo 3.0 软件，采用无监督的主成分分析法（ principal component analysis ， PCA ）和有监督的偏最小二乘 - 判别分析法（ partial least squares discriminant analysis ， PLS-DA ）对获得的多维复杂数据进行降维处理，对各组大鼠血清的代谢物进行分析。课题组前期通过正交偏最小二乘 - 判别分析法（ orthogonal partial least squares discriminant analysis ， OPLS-DA ），根据变量投射重要性（ VIP ）＞ 2 且 P ＜ 0.05 对对照组和模型组大鼠血清进行了差异代谢物的筛选；并进行代谢通路分析（ metabolomics pathway analysis ， MetPA ），根据 impact ＞ 0.02 、 −lg P ＞ 2 筛选出肝纤维化潜在的靶标路径，根据这些路径中所对应的代谢物进一步筛选得到影响肝纤维化发生发展的关键潜在生物标志物 ^[17] 。本研究使用 IBM SPSS Statistics 23.0 软件对各组生物标志物动态研究进行统计学处理，两组间比较采用 Student’s t 检验，多组采用单因素方差分析（ one-way-ANOVA ） 。

3 结果

3.1 蒙古扁桃石油醚提取物对肝纤维化不同发展阶段大鼠血清代谢轮廓的影响

采用 PCA 法对各组大鼠不同时间段血清代谢轮廓进行分析，结果如图 1-A 所示，各组样本聚类良好，在肝疾病发展过程中，模型组与对照组各时间点均呈不同聚类。为更好判别各给药组对代谢谱的影响，采用有监督的 PLS-DA 分析对代谢谱进行最大限度分析，结果如图 1-B 所示，实验第 2 周时，模型组与

对照组之间分离良好，说明肝纤维化疾病早期与正常大鼠之间有明显差异；各给药组从第 2 周时开始与模型组聚类分离，并向对照组移动；第 8 周时，各组聚类最为明显，且回调趋势达到最大程度，说明各给药组在肝纤维化发展过程中对内源 性代谢物产生正向调节作用，并能预防早期肝损伤。 第 8 周时，蒙古扁桃高、中剂量组与模型组分离程度较大，并与对照组有重合，说明高、中剂量蒙古扁桃石油醚提取物抗肝纤维化作用优于低剂量蒙古扁桃石油醚提取物和水飞蓟素。肝纤维化病程各阶段模型所建立数学模型分别为第 2 周 （ R ² _Y ＝ 39% 、 Q ² ＝ 29% ），第 4 周（ R ² _Y ＝ 58% 、 Q ² ＝ 54% ），第 6 周（ R ² _Y ＝ 88% 、 Q ² ＝ 58% ），第 8 周（ R ² _Y ＝ 97% 、 Q ² ＝ 85% ）。结果表明，随造模时间增加，模型建模能力逐步提高，从第 4 周开始模型预测能力均大于 50% ，表明模型具有良好的拟合度和预测能力。第 8 周时 97% 的样本均符合模型判别，模型的预测能力达到 85% 。

3.2 蒙古扁桃石油醚提取物对肝纤维化大鼠血清差异代谢物的影响

课题组前期在实验第 8 周时，根据 VIP ＞ 2 、 P ＜ 0.05 ， 筛选鉴定出 46 种差异代谢物 ^[17] 。为探究蒙古扁桃石油醚提取物对这些差异代谢物的影响，对各组差异代谢物的变化趋势做热图聚类分析，如图 2-A 所示，模型组与对照组显著分开，给药组靠近对照组聚类，并对模型组扰动的肝纤维化差异代谢物具有回调作用。对模型组与对照组、给药组与模型组进行显著性差异比较，以 P 值热图展示，如图 2-B 所示。

根据结果，基于 ANOVA 分析，统计与模型组比 较，各给药组可显著回调的差异代谢物个数，以韦恩图展示，如图 3 和表 1 所示，在模型组显著下调的 27 个差异代谢物中，蒙古扁桃高、中、低剂量组可分别回调 8 、 10 、 6 个（ P ＜ 0.05 ）；在模型组显著上调的 19 个差异代谢物中，蒙古扁桃高、中、低剂量组可分别显著回调 13 、 16 、 13 个（ P ＜ 0.05 ）。蒙古扁桃高、中、低剂量组可共同作用 16 个差异代谢物。

3.3 蒙古扁桃石油醚提取物对肝纤维化大鼠在疾病发展各阶段的血清关键生物标志物的影响

课题组 前期对模型组和对照组大鼠血清中初步鉴定的 46 种差异代谢物进行了 MetPA ，共筛选出 4 条主要参与肝纤维化发生发展的代谢通路，包括鞘脂类代谢，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成与降解，初级胆汁酸合成，甘油磷脂代谢，通路中所对应的代谢物筛选为影响肝纤维化进展的关键潜在生物标志物 ^[17] 。该关键生物标志物的质谱鉴定和代谢通路信息如表 2 所示。为探究蒙古扁桃石油醚提取物在肝纤维不同发展阶段对这些关键标志物的干预作用规律， 9 个关键潜在生物标志物在各组中不同时间点的含量变化如图 4 所示。第 2 周 7 个代谢物鞘氨醇、鞘磷脂、 L - 亮氨酸、 L - 缬氨酸、溶血磷脂（ 17 ∶ 0 ）、磷脂酰胆碱 [18 ∶ 1(11 Z )/20 ∶ 5(5 Z ,8 Z ,11 Z ,14 Z ,17 Z )] 、胆固醇的含量发生显著变化，随疾病发 展模型组大鼠血清标志物呈逐步升高或降低趋势（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），提示这些标志物参与疾病进展全 过程，有望成为早期检测肝纤维化发生、发展的潜在生物标志物。鞘氨醇在第 8 周可被蒙古扁桃高、中剂量组显著回调（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；磷脂酰胆碱水平在第 8 周可被蒙古扁桃中剂量组显著升高（ P ＜ 0.05 ）；鞘磷脂在第 4 周可被蒙古扁桃高、中剂量组显著回调（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），第 8 周蒙古扁桃中剂量组对其有回调作用（ P ＜ 0.01 ）； L - 亮氨酸、 L - 缬氨酸在第 8 周均可被各给药组回调（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；胆固醇在第 4 周可被蒙古扁桃高、中剂量组回调（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），第 8 周可被蒙古扁桃中、低剂量组显著回调（ P ＜ 0.05 ）。甘胆酸和乳糖神经酰胺在第 8 周发生显著变化（ P