单一组学研究瓶颈逐步显现，而近年来，多组学分析策略已是多种类型高分文章的“法宝”。多组学技术是一种结合两种或两种以上组学的研究方法,如将基因组、转录组、蛋白组和代谢组等各组学的数据加以整合分析，这项发展新兴的技术，如今正在引爆下一波研究热点。那么，在肿瘤研究中，多组学技术可以带来怎样的新解法呢？下面小编就为您解析一篇今年2月份发表在 Nature Genetics（IF=30.8）杂志上发表题为Multi-omic profiling of clear cell renal cell carcinoma identifies metabolic reprogramming associated with disease progression的研究论文，内附研究思路！
一、 研究背景
肾细胞癌（RCC）是全球十大最常见的恶性肿瘤之一，主要表现为透明细胞肾细胞癌（ccRCC）。代谢失调是ccRCC的关键特征。到目前为止，大多数临床代谢组学研究仅专注于代谢组学分析，而基因组、表观基因组或其他变化与代谢紊乱之间的关系大多尚未探索。
二、 研究思路
研究人员基于同济医院肾细胞癌（TJ-RCC）队列的100例ccRCC患者样本和50例配对的正常邻近组织（NATs）采用了多组学技术，对ccRCC样本进行全面分析（图1a）, 通过基因组、转录组、蛋白质组以及代谢组等多层面的综合分析，构建ccRCC免疫亚型，深入探索ccRCC的代谢重编程现象及其分子机制，识别潜在的治疗靶点及生物标志物，为个性化治疗提供依据和指导。
图 1a：TJ-RCC 队列中 RCC 队列的多组学特征。
研究思路
三、 结果
1. 基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学分析
在本研究中，研究人员通过对同济医院RCC（TJ-RCC）队列中的样本进行基因组学分析，确认了先前报道的最常见的基因突变。此外，通过共现分析，确定了两对互斥的体细胞突变对：PBRM1-BAP1和BAP1-KDM5C（图1b）。 使用非负矩阵分解（NMF）分析确定了七种体细胞突变特征，并发现这些特征也存在于TJ-RCC队列中。
图 1b：TJ-RCC 队列中 RCC 队列的多组学特征
特别地，确定了49个肿瘤具有与AA相关的突变特征，这些肿瘤表现出更多的体细胞突变，但频繁突变的基因在与AA相关的组中并未显示出显着更高的突变率（图1c）。由于主要的ccRCC驱动基因突变似乎与AA依赖性诱变不相关，因此建议重新评估AA在ccRCC中的作用。
图 1c：TJ-RCC 队列中 RCC 队列的多组学特征
研究发现转录组学和蛋白质组学数据与体细胞拷贝数变异（SCNA）状态密切相关，并通过主成分分析（PCA）显示了肿瘤和正常邻近组织（NATs）之间的显著差异（图1d）。
图 1d：TJ-RCC 队列中 RCC 队列的多组学特征
通路分析揭示了ccRCC组织中血管生成、糖酵解和免疫相关通路的活化，以及几个代谢通路的抑制（图1e、f）。
图 1e-f：TJ-RCC 队列中 RCC 队列的多组学特征代谢组学分析结果与转录组学和蛋白质组学分析结果相关，但在一些代谢途径上存在例外（图1g）。
图 1g：TJ-RCC 队列中 RCC 队列的多组学特征
2. ccRCC可以被分类为四种免疫亚型
研究人员使用公共单细胞RNA测序数据集生成了ccRCC的免疫亚型特征矩阵，将肿瘤样本分成四个免疫亚型（IM1–IM4）（图2a）。IM1亚型的特征是内皮和基质细胞富集，但缺乏免疫细胞特征，提示免疫排斥。IM2肿瘤也富集内皮特征，但缺乏免疫和基质细胞特征。IM3内皮和基质细胞特征水平最低，但T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）评分增加。IM4肿瘤具有最高水平的基质和TAM评分，T细胞评分居中。急性炎症反应和补体级联反应在IM4肿瘤中具有最高的活性。
图 2a：基于 TME 的 ccRCC 分子亚型
研究人员进一步分析了免疫亚型与基因组以及临床特征之间的关联。分析发现，IM4携带最多的驱动型肿瘤体细胞拷贝数变异（SCNAs），而IM3次之，而单核苷酸变异的体细胞突变负担在四个免疫亚型之间没有差异(图2b,c)。
图 2b-c：基于 TME 的 ccRCC 分子亚型此外，与拷贝数变异更多的免疫亚型相关联的是更高的肿瘤级别和更晚期的疾病（图2d）。Kaplan-Meier（KM）分析显示，IM2患者的总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）最佳，而IM4肿瘤与较差的预后相关。
3. 支撑IM1至IM4的免疫细胞群体
为了进一步研究潜在的免疫亚型下细胞组成的异质性。首先，研究者利用单核酸RNA测序（snRNA-seq）和10×多组测序技术对样本进行了分析，将经质量控制后的97,978个单个细胞核分为5种主要细胞类型和41个亚群（图2e、f）。
图 2e-f：基于 TME 的 ccRCC 分子亚型
结果显示，IM1和IM2肿瘤中主要存在单核细胞、LILRB5+巨噬细胞(Mø03–LILRB5)、终末分化效应记忆或效应细胞(TEMRA)以及活化NK细胞(aNK)等。IM3中CD8+T细胞浸润增加，IM4肿瘤中IGF1+巨噬细胞更为丰富（图2g）。
通路分析显示，IM3中干扰素-γ反应和调节T细胞细胞毒作用增强。IM4肿瘤中的IGF1+巨噬细胞富集的区域中富集生长因子复合物通路最后，研究人员假设 IGF1+巨噬细胞促进了成纤维细胞在IM4肿瘤中的积累（图2h）。
图 2h：基于 TME 的 ccRCC 分子亚型
4. 在肿瘤微环境中相关免疫和代谢的异质性
为了深入分析代谢重编程对不同免疫亚型的影响，研究人员评估了每个样本的与代谢相关的基因本体论（GO）术语，并通过无监督聚类揭示了四种不同的代谢基因表达簇。这些簇与胶原和蛋白聚糖代谢、类固醇激素代谢、脂肪酸和氨基酸代谢以及核苷代谢相关。特别是，核苷代谢单独可以区分出免疫亚型中的IM3样本（图3a）。
图 3a：TME 中免疫和代谢异质性之间的相关性
联合分析显示，在IM3样本中，胞嘧啶、嘧啶和其他核苷相关的代谢途径在转录组和蛋白质组水平上得到了增强（图3b）。
随后，相关性分析表明，增加的胞嘧啶/胞嘧啶代谢活性与CD8+T细胞浸润增加和不良预后相关（图3c，d）。
图 3c-d：TME 中免疫和代谢异质性之间的相关性
此外，代谢组数据中观察到IM3样本中胞嘧啶衍生物的增加（图3e）。
图 3e：TME 中免疫和代谢异质性之间的相关性
CD8+T细胞浸润可能限制了ccRCC的肿瘤进展, 为了验证这一发现，研究者还进行了空间转录组学和代谢组学分析。结果显示，在CD8+T细胞浸润的IM3样本中检测到了高浓度的鸟嘌呤和次黄嘌呤信号，而在另一个IM3样本中，虽然存在局部淋巴细胞浸润，但仅检测到了微弱的鸟嘌呤和次黄嘌呤信号（图3f，g）。这些发现表明了ccRCC的肿瘤内异质性（ITH）和胞嘧啶衍生物与TIL之间的潜在相关性。
图 3f-g：TME 中免疫和代谢异质性之间的相关性
这一假设在另一个具有局部CD8+T细胞浸润的样本中得到了进一步确认（图3h–l）。
图 3h-l：TME 中免疫和代谢异质性之间的相关性
5. IM4肿瘤具有独特的代谢特征，并且预后较差。
研究人员通过对不同亚型的基因表达进行比较，发现IM4中包括涉及脂肪酸和氨基酸代谢等多种代谢途径的表达簇3下调，肿瘤在代谢途径上通常呈现出下调状态，说明其代谢紊乱加剧。紧接着，研究人员对IM4与其他免疫亚型之间进行了基因差异表达分析，得到853个差异基因，并聚类为四个模块（图4a）。通过对模块功能的比较分析，模块1和模块2中的基因在IM4肿瘤中的表达高于其他亚型，而模块3中的基因在IM4肿瘤中的表达水平更低（图4a）。这些基因富集于脂肪酸、氨基酸和碳水化合物代谢途径，这些途径的活性降低已被描述为ccRCC的特征（图4b），这些发现表明IM4具有独特的代谢特征。
图 4a-b： DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后
通过Oil red O（ORO）染色验证发现，在非IM4样本中存在脂质滴（LD）积累，而IM4样本中几乎没有观察到LD，与转录组特征一致（图4c）。
图 4c：DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后代谢组学分析结果也验证了这些发现，IM1至IM3肿瘤中与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及精氨酸生物合成相关的代谢物水平较低，而IM4肿瘤中这些生物合成途径也呈下调趋势，表明代谢通路的异常（图4d，e）。
图 4d-e： DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后IM4肿瘤的特征包括营养摄取增加、ROS和LDs水平降低、低代谢活性和较高的增殖率。由于ccRCC的特征是在癌细胞中LD的积累
值得注意的是，IM4肿瘤中的尿素循环受限（图4f，g），但不是由于酶失调所致，可能存在其他未知的机制（图4g）。另一方面，IM4肿瘤中GSH代谢被激活， IM4肿瘤中GSH和氧化GSH（GSSG）均高度富集。不同于GSH高的三阴性乳腺癌，IM4肿瘤中的GSH生物合成底物水平未升高，并且大多数参与GSH生物合成的酶未失调，除了GGT1，该酶催化GSH的谷氨酰基转移，受到下调（图4g）。 尽管构成尿素循环的精氨酸水平在IM4肿瘤中降低，但两种精氨酸衍生物，精胺和精胺，仍然大幅增加（图4f，g）；两者都与癌细胞增殖相关。
图 4f-g：DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后最后，多种基因表达上调，包括葡萄糖、谷氨酰胺等营养物质的转运蛋白，可能导致IM4肿瘤中营养摄取增加（图4h）。图 4h：DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后虽然IM4肿瘤可能吸收额外的葡萄糖，但仅增强了糖醛酸发酵过程，而糖异生被抑制，说明其代谢通路与其他亚型不同（图4i）。
图 4i：DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后综上所述，IM4肿瘤的特征包括营养摄取增加、ROS和LD水平降低、代谢活性降低以及增殖率增高（图4j）。由于ccRCC的特点是癌细胞中的低密度脂蛋白积累，文章中将这一过程命名为ccRCC的去清细胞分化（DCCD-ccRCC）。
图 4j：DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后此外，研究发现，患有DCCD-ccRCC的患者在肾脏限制性ccRCC中有着更差的总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）（图4k），表明仅仅通过手术治疗可能不足以治愈这些患者，建议在手术后对这些患者进行进一步的治疗。
图 4k：DCCD 亚型在 ccRCC 中表现出明显的代谢紊乱和较差的预后
6. IM亚型与治疗效果相关。
为了确定DCCD（IM4）和非DCCD（IM1-IM3）ccRCC患者的潜在治疗方案，研究分析了三项临床试验的大样本RNA-seq数据。在IMmotion 151试验中，对于IM3和IM4（也称为DCCD）亚型患者，联合使用阿特祖单抗和贝伐珠单抗比单独使用舒尼替尼能够改善预后（图5a–c）。
图 5a-c：IM 亚型与治疗效果有关随后在JAVELIN试验中，DCCD患者通常表现出较差的预后（图5d，e）。联合使用阿维鲁单抗和阿西替尼治疗能够改善IM1、IM3和IM4患者的无进展生存期（PFS）（图5f），尤其是IM1组可能因其高表达血管生成相关基因而从此治疗中获益（图5c,f）。然而，对于IM2患者，抗血管生成治疗与免疫检查点阻断联合治疗并不具有益处。
图 5d-f：IM 亚型与治疗效果有关此外，Meta-checkmate队列的分析表明，患者分层影响了尼伐单抗治疗的转移性肾癌（mRCC）患者的总生存期（OS），但对PFS没有影响（图5g，h）。
图 5g-h：IM 亚型与治疗效果有关相比使用依维莫司治疗，使用在尼伐单抗治疗延长了IM2和IM3转移性肾癌患者患者OS（图5i）。
图 5i：IM 亚型与治疗效果有关
7. ccRCC中从非DCCD到DCCD的亚簇水平转变
通过单样本基因集富集分析（ssGSEA），IM2和IM4样本分别显示了介于IM1和IM3之间的中间得分，其特征IM1和IM3样本呈反相关（图6a），支持了ccRCC中持续DCCD的假设。研究人员根据显性基因特征将这些样本分别命名为IM2-like或IM4-like，并将DCCD评分定义为IM4和IM2分数的差值（图6a，b）。
图 6a-b：在 ccRCC 中可以观察到从非 DCCD 到 DCCD 的亚簇水平转变KM分析显示，IM4-like肿瘤患者的OS和PFS优于IM4肿瘤，但比IM2和IM2-like肿瘤的患者差（图6c）。尽管IM1和IM3肿瘤之间TME存在显著差异。早期病例中，较高的IM4评分也与不良预后相关，这表明DCCD进展程度可能决定了ccRCC患者的预后。
图 6c：在 ccRCC 中可以观察到从非 DCCD 到 DCCD 的亚簇水平转变对单细胞RNA测序数据的后续分析，揭示了与批量RNA测序数据中观察到的IM2和IM4得分之间相同的反向相关关系（图6d,e）。根据DCCD分数，将单个癌细胞分为IM2-like或IM4-like表型，并发现IM2-like或IM4-like细胞的比例与批量-seq水平上的DCCD分数相关，表明DCCD过程反映了肿瘤内IM4-like癌细胞的积累（图6f）。
图 6d-f：在 ccRCC 中可以观察到从非 DCCD 到 DCCD 的亚簇水平转变由于DCCD-ccRCC通常比IM1–IM3肿瘤含有更多的染色体臂水平的SCNA，研究人员探讨了SCNA事件是否驱动了DCCD过程，发现在snRNA-seq数据中，仅有部分肿瘤呈现DCCD特征的恶性细胞中发现了亚克隆性SCNA（图6g）。
图 6g：在 ccRCC 中可以观察到从非 DCCD 到 DCCD 的亚簇水平转变在具有空间剖面的12个ccRCC样本中，发现了两个样本存在部分DCCD（图6h，i）。
图 6h-j：在 ccRCC 中可以观察到从非 DCCD 到 DCCD 的亚簇水平转变空间代谢组分析显示，DCCD区域的脂肪酸数量较少，尤其是长链脂肪酸，不受亚克隆性SCNA存在的影响（图6k，l）。
图 6k-l：在 ccRCC 中可以观察到从非 DCCD 到 DCCD 的亚簇水平转变
8. 建立DCCD发展轨迹
为了更深入地了解DCCD转化过程，研究人员利用单细胞RNA测序数据构建了向DCCD转变的轨迹。IM4样的单细胞位于轨迹末端，伪时间内IM4评分逐渐增加，而IM2评分逐渐减少（图7a，b）。
图 7a-b：利用多组学数据建立 DCCD 的轨迹随后，研究人员提取差异表达的转录因子，结果将83个差异表达的转录因子分成了两个簇（图7c），结果发现，与DCCD相关的转录因子包括HNF1A、HNF1B、HNF4A和PPARA等，这些因子与肾小管发育、ccRCC的发生以及维持正常肾小管代谢特征等方面有关。
此外，雄激素受体在DCCD中下调，而HIF1A在转变朝向DCCD的后期阶段显著上调（图7d-g），突显了在DCCD过程中基因调控的重要性。
图 7d-g：利用多组学数据建立 DCCD 的轨迹转录因子分析表明，与DCCD相关的关键转录因子的连续变化在批量测序和单细胞测序数据中高度一致（图7h，i）。
图 7h-i：利用多组学数据建立 DCCD 的轨迹对单细胞ATAC测序（snATAC-seq）数据进行的ChromVAR偏差分析，揭示了DCCD和非DCCD群体之间差异最大的激活的转录因子。在这项分析中，发现AP-1转录因子亚基排名最高，其次是BACH1、BACH2和肝细胞核因子家族成员（图8a）。通过基序足迹分析的结果也进一步证实了这些转录因子的活化情况（图8b）。
图 8a-b：snATAC-seq 揭示了参与 DCCD 的转录因子基序足迹分析显示，H46_T的雄激素受体结合位点在所有样本中的可用性最高（图8c–e）。
图 8c-e：snATAC-seq 揭示了参与 DCCD 的转录因子尽管存在样本特异性的峰-基因连接特征。其中，一个位于LRP2启动子上游约30k的峰与LRP2的表达呈正相关。此外，在癌细胞中还发现了几个与CEBPB表达相关的峰，可能是促进CEBPB表达的增强子（图8f、g）。
图 8f-g：snATAC-seq 揭示了参与 DCCD 的转录因子通过scMEGA分析，得以构建了DCCD和非DCCD癌细胞的独立基因调控网络（图8h）。总体来看，这些数据提供了有关参与ccRCC进展的转录因子调控网络的见解。图 8h：snATAC-seq 揭示了参与 DCCD 的转录因子
四、 讨论
这篇文章为我们提供了一种全面、多层次的肿瘤研究方法，这也是首篇整合了基因组学，转录组学，蛋白组学，代谢组学和空间信息的ccRCC多组学图谱，内容很多但是思路清晰，这也是能发高分的一大亮点。
参考文献
[1] Hu, J., Wang, SG., Hou, Y. et al. Multi-omic profiling of clear cell renal cell carcinoma identifies metabolic reprogramming associated with disease progression. Nat Genet 56, 442–457 (2024). https://doi.org/10.1038/s41588-024-01662-5
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