自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，给患者及其家庭带来了诸多挑战。近年来，肠道微生物群在自闭症发病机制中的作用备受关注，但大多数研究主要集中在细菌成分。香港中文大学的 Qi Su、Oscar W. H. Wong 等人在Nature Microbiology（IF = 20.5）上发表的“Multikingdom and functional gut microbiota markers for autism spectrum disorder” 研究中，通过对1627名儿童的粪便样本进行宏基因组测序，深入分析了肠道微生物群中细菌、古菌、真菌和病毒等多界微生物的组成和功能变化，发现了一系列与自闭症相关的微生物标志物，为自闭症的诊断提供了新的潜在方法。
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5 + 肠道微生物 自闭症等神经发育障碍
一、研究背景与意义
自闭症的病因尚不清楚，目前认为与遗传和环境因素的复杂相互作用有关。过去十年，肠道微生物群被发现通过调节神经免疫网络和与大脑直接通讯，在调节肠脑轴中发挥关键作用，可能与自闭症的发展有关。然而，此前大多数研究仅关注细菌，对古菌、真菌和病毒以及肠道微生物群的功能在自闭症中的变化尚不清楚。本研究旨在填补这一空白，通过多界微生物分析，寻找自闭症的潜在诊断标志物，为自闭症的早期诊断和干预提供新的依据。
二、研究方法与过程
（一）研究对象
本研究共招募了 1627 名 1 - 13 岁儿童，包括五个独立队列（图 1a）：
1. 发现队列：709 名自闭症儿童和 374 名神经正常儿童，年龄 3 - 12 岁，来自香港新界东医院联网儿童及青少年精神科诊所，诊断基于 DSM - 5 标准。
2. 独立医院队列：82 名自闭症儿童和 90 名神经正常儿童，年龄 4 - 11 岁，用于独立验证标志物和模型性能。
3. 独立社区队列：116 名自闭症儿童和 60 名神经正常儿童，年龄 1 - 8 岁，验证社区环境中标志物和模型准确性。
4. 独立注意力缺陷多动障碍（ADHD）队列：42 名 ADHD 儿童和 76 名神经正常儿童，年龄 1 - 13 岁，评估标志物特异性。
5. 独立特应性皮炎队列：40 名特应性皮炎儿童和 38 名对照儿童，年龄 1 岁，验证标志物特异性。
图1 ASD与粪便微生物组成的关系
（二）样本采集与处理
1. 粪便样本在家中采集，使用含 Norgen preservative media 的管子，24 小时内送至医院， - 80°C 储存。
2. 样本处理遵循相同标准化方案，使用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒提取微生物 DNA，经质量控制后构建 DNA 文库，在 Illumina NovaSeq 系统上测序（150bp，双端测序）。
（三）数据分析
1. 测序数据预处理：用 Trimmomatic 过滤质量，bowtie2 比对去除宿主和污染序列，GNU parallel 加速处理。
2. 微生物分类和功能分析：Kraken 2 分类，Bracken 估计丰度，HUMAnN 分析功能途径和 KO 基因家族，数据经 CLR 转换。
3. 计算微生物 - 表型关联：用 PERMANOVA 分析微生物组成与表型关联，MMUPHin 计算微生物群多样性，MaAsLin2 分析微生物特征与 ASD 关联。
4. 构建随机森林分类器：用 R 包 randomForest 训练模型，caret 包调参，重复 20 次随机分割评估模型性能。
三、研究结果
（一）自闭症相关微生物物种变化
1. 研究发现 21 个因素显著影响肠道微生物群组成，调整这些因素后，发现自闭症儿童的古菌、细菌和病毒多样性降低（图 1b、c）。
2. 共鉴定出 14 种古菌、51 种细菌、7 种真菌和 18 种病毒在自闭症儿童与神经正常儿童中存在差异丰度，其中 80 种在自闭症儿童中减少，细菌群落变化最明显（图 1d）。例如，嗜热链球菌和产短链脂肪酸的细菌如 Bacteroides sp. PHL2737 和 Lawsonibacter asaccharolyticus 在自闭症儿童中减少。
（二）肠道微生物群功能变化
1. 宿主表型因素解释了微生物群途径和基因变异的 17.1% 和 15.7%，ASD 是主要影响因素（图 2a）。
2. 鉴定出 27 个差异 KO 基因（23 个减少，4 个增加）和 12 个差异途径，如泛醌 - 7 和硫胺素二磷酸的生物合成途径在自闭症儿童中减少（图 2b、c）。泛醌具有抗氧化活性，硫胺素二磷酸合成受损与自闭症及其他精神障碍有关，ASD 与 γ - 氨基丁酸（GABA）分流途径呈负相关。
图2 ASD与粪便微生物群功能之间的关系
（三）单界微生物标志物诊断 ASD 的能力
1. 为避免样本量不平衡和残余混杂因素影响，构建了匹配子队列（各 301 名儿童）。
2. 单界标志物中，微生物途径模型预测能力最强（AUC = 0.87），其次是微生物基因、细菌、古菌、真菌和病毒模型（图 3b）。
图3 随机森林模型在自闭症诊断中的应用
（四）多界微生物标志物诊断 ASD 的优势
1. 组合多界特征的集成模型（AUC = 0.91）优于单界模型（图 3b），确定了 31 个微生物特征的组合可实现较高诊断准确性（AUC = 0.91）。
2. 这些标志物在不同队列中对自闭症诊断具有稳健性，在独立医院队列中 AUC 为 0.87，在社区队列中不同年龄组也表现良好（图 4a），在公共数据集中 AUC 为 0.78 且性别间表现相当（Extended Data Fig. 7）。
3. 31 标志物面板在非 ASD 疾病（ADHD 和特应性皮炎）队列中 AUC 较低，特异性较高（图 4c）。
图4 随机森林模型在验证集结果
补充图7 基于公共数据库的31个marker验证
（五）关键代谢途径与自闭症的关联
1. 泛醌 - 7 和硫胺素二磷酸生物合成途径在自闭症儿童中减少，涉及这两个途径的 17 种酶在不同队列中大多在自闭症儿童中减少（图 4b、Extended Data Fig. 8），提示其与自闭症密切相关。
补充图8 泛醇-7和硫胺素二磷酸生物合成基因丰度在不同队列的ASD儿童中降低
四、研究讨论与结论
（一）主要发现与意义
1. 本研究首次全面分析了自闭症儿童肠道微生物群中多界微生物组成和功能变化，发现古菌、真菌和病毒物种以及功能微生物群途径可区分自闭症儿童与神经正常儿童。
2. 确定的 31 种多界微生物标志物组合为自闭症的非侵入性诊断提供了潜在工具，有助于早期识别和干预。
（二）研究的创新性与局限性
1. 创新性：系统评估宿主变量和技术因素对肠道微生物群的影响，调整混杂因素；采用配对算法构建机器学习模型，提高模型稳健性；发现微生物功能途径在诊断中的价值，多界标志物组合提高诊断准确性。
2. 局限性：横断面研究无法确定因果关系；未分析基因型对微生物群的影响；配对算法可能引入未知偏差；需更多独立验证和前瞻性研究。
（三）未来研究方向
1. 开展前瞻性研究，结合遗传标记和微生物群面板，提高诊断准确性，探索疾病预防。
2. 深入研究多界微生物物种间的相互作用及其在自闭症发病机制中的作用。
3. 进一步验证模型在不同神经发育状况、常见儿童疾病和地理区域中的普遍性和临床适用性。
（四）对自闭症研究和临床应用的影响
本研究为自闭症的诊断提供了新视角和方法，推动了自闭症微生物组研究领域的发展。未来，基于肠道微生物群的诊断工具可能成为自闭症临床管理的重要辅助手段。
五、总结
本研究通过大规模宏基因组测序分析，揭示了自闭症儿童肠道微生物群多界微生物的特征变化，确定了具有潜在诊断价值的微生物标志物组合。这些发现为自闭症的诊断和发病机制研究提供了重要依据，虽然研究存在一定局限性，但为未来的研究和临床应用奠定了基础。相信随着研究的深入，肠道微生物群将在自闭症的早期诊断、干预和治疗中发挥更大的作用。
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